Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат.Сиз колдонуп жаткан серепчинин версиясы чектелген CSS колдоосуна ээ.Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү).Ал ортодо, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Toxoplasma gondii – клетка ичиндеги протозоандык мите, ал жуккан ээсинин микрочөйрөсүн модуляциялайт жана мээ шишигинин өсүшү менен байланышкан.Бул изилдөөдө биз Toxoplasma инфекциясынан алынган экзосомалык miRNA-21 мээ шишигинин өсүшүнө өбөлгө түзөт деп болжолдойбуз.Toxoplasma менен жуккан BV2 микроглиясынан экзосомалар мүнөздөлгөн жана U87 глиома клеткаларынын интернационализациясы тастыкталган.Экзосомалык микроРНК экспрессия профилдери Toxoplasma gondii жана шишик сорттоо менен байланышкан microRNA жана microRNA-21A-5p массивдерин колдонуу менен талданды.Биз ошондой эле U87 глиома клеткаларындагы шишик менен байланышкан гендердин mRNA деңгээлдерин экзосомалардагы miR-21 деңгээлин жана экзосомалардын адамдын U87 глиома клеткасынын пролиферациясына тийгизген таасирин изилдедик.Toxoplasma gondii менен жуккан U87 глиома клеткаларынын экзосомаларында микроРНК-21 экспрессиясы жогорулайт жана шишикке каршы гендердин (FoxO1, PTEN жана PDCD4) активдүүлүгү төмөндөйт.Toxoplasma менен ооруган BV2-туунду экзосомалар U87 глиома клеткаларынын пролиферациясын жаратат.Экзосомалар чычкандын шишигинин моделинде U87 клеткаларынын өсүшүн шарттайт.Биз Toxoplasma жуккан BV2 микроглиясында көбөйгөн экзосомалык miR-21 антитумор гендерди төмөндөтүп, U87 глиома клеткаларында клетканын өсүшүнө көмөкчү катары маанилүү ролду ойношу мүмкүн деп сунуштайбыз.
2018-жылы дүйнө жүзү боюнча 18,1 миллиондон ашык рак оорусунун өнүккөн учурлары аныкталган, жылына 297 000ге жакын борбордук нерв системасынын шишиги (бардык шишиктердин 1,6%)1 диагнозу коюлган.Мурунку изилдөөлөр көрсөткөндөй, адамдын мээсинин шишигинин пайда болушу үчүн тобокелдик факторлору ар кандай химиялык продуктуларды, үй-бүлөлүк тарыхты жана баштын терапиялык жана диагностикалык жабдуулардан иондоштуруучу нурланууну камтыйт.Бирок, бул залалдуу оорулардын так себеби белгисиз.Дүйнө жүзү боюнча бардык рактын болжол менен 20% жугуштуу агенттерден, анын ичинде вирустар, бактериялар жана мите курттар себеп болот3,4.Жугуштуу козгогучтар кабыл алуучу клетканын генетикалык механизмдерин, мисалы, ДНКны оңдоо жана клетка циклин бузуп, өнөкөт сезгенүүгө жана иммундук системанын бузулушуна алып келиши мүмкүн5.
Адамдын рагы менен байланышкан инфекциялык агенттер эң кеңири таралган вирустук козгогучтар, анын ичинде адамдын папилломавирустары жана В жана С гепатитинин вирустары.Паразиттер адамдын рак оорусунун өнүгүшүнө да потенциалдуу роль ойной алат.Мителердин бир нече түрлөрү, атап айтканда Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis жана Hymenolepis nana адамдын рак оорусунун ар кандай түрлөрүнө катышы бар 6,7,8.
Toxoplasma gondii – инфекция жуккан кабыл алуучу клеткалардын микрочөйрөсүн жөнгө салуучу клетка ичиндеги протозой.Бул мите дүйнө калкынын болжол менен 30% жугузуп, бүт калкты тобокелге салат9,10.Toxoplasma gondii маанилүү органдарды, анын ичинде борбордук нерв системасын (ЦНС) жугузушу мүмкүн жана өлүмгө алып баруучу менингит жана энцефалит сыяктуу олуттуу ооруларды, өзгөчө иммунитети начар пациенттерде9 пайда кылышы мүмкүн.Бирок, Toxoplasma gondii ошондой эле иммундук компетенттүү адамдарда клетканын өсүшүн жана иммундук жоопторду модуляциялоо жолу менен инфекция жуккан ээсинин чөйрөсүн өзгөртө алат, бул асимптоматикалык өнөкөт инфекциянын сакталышына алып келет9,11.Кызыктуусу, T. gondii таралышы менен мээнин шишигинин оорусунун ортосундагы корреляцияны эске алуу менен, кээ бир отчеттор өнөкөт T. gondii инфекциясынын натыйжасында in vivo чөйрөдөгү өзгөрүүлөр шишик микрочөйрөсүнө окшош экенин көрсөтүп турат.
Экзосомалар биологиялык мазмунду, анын ичинде белокторду жана нуклеиндик кислоталарды кошуна клеткалардан жеткирүүчү клетка аралык коммуникаторлор катары белгилүү.Экзосомалар шишик микрочөйрөсүндө анти-апоптоз, ангиогенез жана метастаз сыяктуу шишик менен байланышкан биологиялык процесстерге таасир этиши мүмкүн.Атап айтканда, миРНКлар (miRNAs), узундугу болжол менен 22 нуклеотидди түзгөн кичинекей коддолбогон РНКлар, миРНК-индукцияланган үнсүздүрүү комплекси (miRISC) аркылуу адамдын мРНКсынын 30% дан ашыгын башкарган маанилүү пост-транскрипция ген жөнгө салуучулар болуп саналат.Toxoplasma gondii жуккан хосттордо miRNA экспрессиясын көзөмөлдөө менен биологиялык процесстерди бузушу мүмкүн.Хост миРНКлары паразиттин жашоо стратегиясына жетүү үчүн биологиялык процесстерди жөнгө салуу үчүн маанилүү сигналдарды камтыйт.Ошентип, T. gondii менен инфекция жуккандан кийин кабыл алуучу miRNA профилиндеги өзгөрүүлөрдү изилдөө хозяин менен T. gondii ортосундагы өз ара аракеттенүүнү такыраак түшүнүүгө жардам берет.Чынында эле, Thirugnanam et al.15 T. gondii шишиктин өсүшү менен байланышкан белгилүү бир кабыл алуучу miRNAs боюнча анын экспрессиясын өзгөртүү менен мээ carcinogenesis өбөлгө түзөт жана T. gondii эксперименталдык жаныбарлардын глиомаларды алып келиши мүмкүн деп табылган.
Бул изилдөө Toxoplasma BV2 менен жуккан кабыл алуучу микроглиядагы экзосомалык miR-21дин өзгөрүшүнө багытталган.Биз FoxO1/p27 ядросунда кармалып калуудан улам U87 глиома клеткаларынын өсүшүндө өзгөртүлгөн экзосомалык miR-21дин мүмкүн болгон ролун байкадык, ал ашыкча экспрессияланган miR-21 максаты болуп саналат.
BV2ден алынган экзосомалар дифференциалдык центрифугалоо аркылуу алынган жана клеткалык компоненттер же башка весикулалар менен булганууну болтурбоо үчүн ар кандай ыкмалар менен тастыкталган.SDS-полиакриламиддик гел электрофорези (SDS-PAGE) BV2 клеткаларынан жана экзосомалардан алынган белоктордун ортосундагы айырмаланган үлгүлөрдү көрсөттү (Figure 1A) жана үлгүлөр Аликстин бар экендиги үчүн бааланган, ал экзосомалык протеин маркерлеринин Батыш блоттору менен талданган.Аликс энбелгиси экзосома белокторунда табылган, бирок BV2 клеткасынын лизат протеиндеринде эмес (сүрөт 1B).Мындан тышкары, BV2ден алынган экзосомалардан тазаланган РНК биоанализердин жардамы менен анализденди.18S жана 28S рибосомалык суббирдиктер экзосомалык РНК миграциясынын үлгүсүндө сейрек байкалган, бул ишенимдүү тазалыкты көрсөтүп турат (Figure 1C).Акыр-аягы, трансмиссиялык электрондук микроскоп байкалган exosomes болжол менен 60-150 нм өлчөмүн жана exosome morphology мүнөздүү чөйчөк сымал түзүлүшкө ээ экенин көрсөттү (сүрөт. 1D).
BV2 клеткаларынан алынган экзосомалардын мүнөздөмөсү.(A) Коопсуздук маалымат баракчасынын бети.Белоктор BV2 клеткаларынан же BV2ден алынган экзосомалардан бөлүнүп алынган.Протеин үлгүлөрү клеткалар менен экзосомалардын ортосунда айырмаланат.(B) экзосомалык маркердин (Аликс) Western Blot анализи.(C) биоанализерди колдонуу менен BV2 клеткаларынан жана BV2 алынган экзосомалардан тазаланган РНКны баалоо.Ошентип, BV2 клеткаларындагы 18S жана 28S рибосомалык суббирдиктер экзосомалык РНКда сейрек кездешкен.(D) Трансмиссиялык электрондук микроскоп BV2 клеткаларынан бөлүнүп алынган экзосомалар 2% уранил ацетат менен терс боёлгондугун көрсөттү.Экзосомалар болжол менен 60-150 нм өлчөмүндө жана чөйчөк сымал (Сонг жана Юнг, жарыяланбаган маалыматтар).
U87 адамдын глиома клеткаларына BV2ден алынган экзосомалардын уюлдук интернационализациясы конфокалдык микроскопиянын жардамы менен байкалган.PKH26 менен белгиленген экзосомалар U87 клеткаларынын цитоплазмасында локализацияланган.Ядролор DAPI (сүрөт 2A) менен боёлгон, бул BV2ден алынган экзосомалар кабыл алуучу клеткалар тарабынан ичкерилет жана алуучу клеткалардын чөйрөсүнө таасир эте алат.
BV2-туунду экзосомаларын U87 глиома клеткаларына жана BV2-туунду экзосомаларына Internalization Toxoplasma RH менен жуккан U87 глиома клеткаларынын пролиферациясын шарттады.(A) конфокалдык микроскопия менен өлчөнгөн U87 клеткалары менен капталган экзосомалар.U87 глиома клеткалары PKH26 (кызыл) менен белгиленген экзосомалар менен же 24 саат бою көзөмөлсүз инкубацияланган.Ядролор DAPI (көк) менен боёлуп, андан кийин конфокалдык микроскоптун астында байкалган (масштаб тилкеси: 10 мкм, х 3000).(B) U87 glioma клетка көбөйүшү клетка таралышын талдоо менен аныкталган.U87 глиома клеткалары көрсөтүлгөн убакыттын ичинде экзосомалар менен дарыланган. *P < 0,05 Студенттин t тести аркылуу алынган. *P < 0,05 Студенттин t тести аркылуу алынган. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. * П < 0,05 Студенттин t-тести боюнча. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 Студенттин t-тестинин жардамы менен алынган.
BV2 алынган экзосомалардын U87 глиома клеткаларына интернационализациясын ырастагандан кийин, адамдын глиома клеткаларынын өнүгүшүндө BV2 алынган токсоплазмадан алынган экзосомалардын ролун изилдөө үчүн клетканын пролиферациясын анализддик.T. gondii жуккан BV2 клеткаларынан экзосомалар менен U87 клеткаларын дарылоо T. gondii жуккан BV2 алынган экзосомалар башкарууга салыштырмалуу U87 клеткаларынын бир кыйла жогору пролиферациясын шарттаганын көрсөттү (сүрөт 2B).
Мындан тышкары, U118 клеткаларынын өсүшү U87 сыяктуу эле натыйжаларга ээ болгон, анткени токсоплазма стимулдаган экзосомалар пролиферациянын эң жогорку деңгээлине алып келген (маалыматтар көрсөтүлгөн эмес).Бул маалыматтардын негизинде, биз BV2 келип чыккан Toxoplasma-инфекцияланган экзосомалар глиома клеткаларынын көбөйүүсүндө маанилүү ролду ойной тургандыгын көрсөтө алабыз.
Токсоплазма менен жуккан BV2 келип чыккан экзосомалардын шишиктин өнүгүшүнө таасирин изилдөө үчүн биз U87 глиома клеткаларын жылаңач чычкандарга ксеногрант модели үчүн сайдык жана BV2 алынган экзосомаларды же RH-жугузган BV2-туунду экзосомаларын сайдык.Шишиктер 1 жумадан кийин айкын болгондон кийин, 5 чычкандан турган ар бир эксперименталдык топ бирдей баштапкы чекитти аныктоо үчүн шишиктин өлчөмүнө жараша бөлүнгөн жана шишик өлчөмү 22 күн бою ченелген.
U87 xenograft модели менен чычкандарда, бир кыйла чоңураак шишик өлчөмү жана салмагы 22 күнү BV2 алынган RH-жугузуп exosome тобу байкалган (сүрөт. 3A, B).Башка жагынан алып караганда, BV2 алынган exosome тобу жана exosome дарылоо кийин контролдоо тобунун ортосунда шишик өлчөмү боюнча эч кандай олуттуу айырма болгон жок.Мындан тышкары, глиома клеткалары жана экзосомалар менен сайылган чычкандар RH-жугузган BV2-алынган экзосомалар тобунда эң чоң шишик көлөмүн көрсөттү (сүрөт 3C).Бул жыйынтыктар BV2 келип чыккан токсоплазманы жуктурган экзосомалар чычкан шишигинин моделинде глиоманын өсүшүн шарттайт.
U87 ксеногрант чычкан моделиндеги BV2ден алынган экзосомалардын онкогенези (AC).Шишик өлчөмү (A) жана салмагы (B) BV2 алынган RH-жугузган exosomes менен мамиле BALB / c жылаңач чычкандардын бир кыйла көбөйгөн.BALB/c жылаңач чычкандарга (C) Matrigel аралашмасында токтотулган 1 x 107 U87 клеткалары тери астына сайылган.Инъекциядан алты күн өткөндөн кийин, чычкандарга 100 мкг BV2 алынган экзосомалар дарыланган.Шишиктин өлчөмү жана салмагы көрсөтүлгөн күндөрдө жана курмандык чалынгандан кийин өлчөнгөн. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05.
маалыматтар 37 miRNAs (16 overexpressed жана 21 downexpressed) иммунитет же шишик өнүктүрүү менен байланышкан Toxoplasma RH штамм (сүрөт. 4A) менен жуккандан кийин microglia олуттуу өзгөртүлгөн экенин көрсөттү.Өзгөрүлгөн miRNAs арасында miR-21 салыштырмалуу экспрессия деңгээл BV2 алынган exosomes, BV2 жана U87 клеткалары менен мамиле exosomes реалдуу убакыт RT-PCR менен тастыкталган.miR-21 экспрессиясы Toxoplasma gondii (RH штаммы) менен ооруган BV2 клеткаларынан экзосомалардын олуттуу өсүшүн көрсөттү (сүрөт 4B).BV2 жана U87 клеткаларындагы miR-21дин салыштырмалуу экспрессия деңгээли өзгөргөн экзосомаларды кабыл алгандан кийин көбөйдү (сүрөт 4B).Toxoplasma gondii (ME49 штаммы) менен ооруган шишик менен ооруган чычкандардын мээ кыртыштарында miR-21 экспрессиясынын салыштырмалуу деңгээли көзөмөлгө караганда жогору болгон (сүрөт. 4C).Бул натыйжалар in vitro жана in vivo болжолдонгон жана тастыкталган микроРНКлардын экспрессия деңгээлдеринин ортосундагы айырмачылыктар менен байланышат.
Toxoplasma gondii (RH) менен ооруган микроглиядагы экзосомалык miP-21a-5p экспрессиясынын өзгөрүшү.(A) T. gondii RH инфекциясынан кийин иммунитетке же шишиктин өнүгүшүнө байланыштуу siRNAдагы олуттуу өзгөрүүлөрдү көрсөтөт.(B) Салыштырмалуу miR-21 сөз деңгээл BV2 алынган exosomes, BV2 мамиле exosomes жана U87 клеткаларында реалдуу убакыт RT-PCR тарабынан аныкталган.(C) Салыштырмалуу miR-21 экспрессия деңгээли шишик менен ооругандардын мээ кыртыштарында табылган (N = 3) жана Toxoplasma gondii (ME49 штаммы) менен ооруган чычкандар (N = 3). *P < 0,05 Студенттин t тести аркылуу алынган. *P < 0,05 Студенттин t тести аркылуу алынган. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 Студенттин t-тестинин жардамы менен алынган. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 Студенттин t-тестинин жардамы менен алынган.
RH-инфекцияланган BV2 клеткаларынан экзосомалар in vivo жана in vitro шартында глиомалардын өсүшүнө алып келген (сүрөт 2, 3).Тиешелүү mRNAларды аныктоо үчүн биз BV2 же RH BV2ден алынган экзосомалар менен жуккан U87 клеткаларындагы шишикке каршы максаттуу гендердин mRNA деңгээлин, айры куту O1 (FoxO1), PTEN жана программаланган клетка өлүмү 4 (PDCD4) изилдедик.Биоинформатика анализи бир нече шишик менен байланышкан гендер, анын ичинде FoxO1, PTEN жана PDCD4 гендеринде miR-2121,22 байланыш жерлери бар экенин көрсөттү.Шишикке каршы максаттуу гендердин мРНК деңгээли RH-жугузган BV2-туунду экзосомаларда BV2-туунду экзосомаларга салыштырмалуу кыскарган (сүрөт 5A).FoxO1 BV2-туунду экзосомалар менен салыштырганда RH-жугузган BV2-туунду экзосомаларында протеиндин азайгандыгын көрсөттү (Figure 5B).Бул натыйжалардын негизинде, биз RH-инфекцияланган BV2ден алынган экзосомалар шишиктин өсүшүндөгү ролун сактап, анти-онкогендик гендерди төмөндөтөөрүн тастыктай алдык.
Toxoplasma RH-инфекцияланган BV2-туунду экзосомалар U87 глиома клеткаларындагы шишикке каршы гендердин Toxoplasma RH-жугузган BV2-туунду экзосомалар тарабынан басылышын шарттайт.(A) PBS exosomes салыштырмалуу T. gondii RH жуккан BV2 алынган exosomes менен FoxO1, PTEN жана PDCD4 билдирүү реалдуу убакыт ПТР.β-актин мРНК башкаруу катары колдонулган.(B) FoxO1 туюнтмасы Western blotting менен аныкталган жана densitometry маалыматтары ImageJ программасын колдонуу менен статистикалык бааланган. *P < 0,05 Студенттин t тести аркылуу алынган. *P < 0,05 Студенттин t тести аркылуу алынган. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 Студенттин t-тестинин жардамы менен алынган. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 Студенттин t-тестинин жардамы менен алынган.
Экзосомалардагы miP-21 шишик менен байланышкан ген жөнгө салуу таасирин түшүнүү үчүн, U87 клеткалары Lipofectamine 2000 колдонуу менен miP-21 ингибитору менен трансфекцияланган жана клеткалар трансфекциядан кийин 24 сааттан кийин жыйналган.miR-21 ингибиторлору менен трансфекцияланган клеткалардагы FoxO1 жана p27 экспрессия деңгээли qRT-PCR колдонуу менен BV2 алынган экзосомалар менен дарыланган клеткалар менен салыштырылган (сүрөт 6A, B).miR-21 ингибиторунун U87 клеткаларына трансфекциясы FoxO1 жана p27 экспрессиясын олуттуу төмөндөттү (сүрөт 6).
RH-жугузган экзосомалык BV2 алынган miP-21 U87 глиома клеткаларында FoxO1 / p27 экспрессиясын өзгөрттү.U87 клеткалары Lipofectamine 2000 колдонуу менен miP-21 ингибитору менен трансфекцияланган жана клеткалар трансфекциядан кийин 24 сааттан кийин жыйналган.miR-21 ингибиторлору менен трансфекцияланган клеткалардагы FoxO1 жана p27 экспрессия деңгээли qRT-PCR (A, B) колдонуу менен BV2 алынган экзосомалар менен мамиле кылган клеткалардагы деңгээлдер менен салыштырылган.
Кожоюндун иммундук реакциясынан качуу үчүн токсоплазма мите ткандардын кистасына айланат.Алар ар кандай ткандарды, анын ичинде мээни, жүрөктү жана скелет булчуңдарын ээсинин өмүр бою мителик кылышат жана ээсинин иммундук реакциясын модуляциялашат.Мындан тышкары, алар клетка циклин жана кабыл алуучу клеткалардын апоптозун жөнгө салып, алардын көбөйүшүнө көмөктөшөт14,24.Toxoplasma gondii негизинен дендриттик клеткаларды, нейтрофилдерди жана моноцит/макрофаг тукумун, анын ичинде мээнин микроглиясын жугат.Toxoplasma gondii M2 фенотипиндеги макрофагдардын дифференциациясын индукциялайт, патогендик инфекциядан кийин жарааттын айыгышына таасирин тийгизет, ошондой эле гиперваскуляризация жана грануломатоздук фиброз менен байланышкан.Toxoplasma инфекциясынын бул жүрүм-турум патогенези шишиктин өнүгүшү менен байланышкан маркерлерге байланыштуу болушу мүмкүн.Токсоплазма менен жөнгө салынган душмандык чөйрө тиешелүү рак оорусуна окшош болушу мүмкүн.Ошондуктан, Toxoplasma жугуштуу мээ шишигинин өнүгүшүнө өбөлгө болушу керек деп божомолдоого болот.Чынында, ар кандай мээ шишиктери бар бейтаптардын кан сары суусунда токсоплазма инфекциясынын жогорку көрсөткүчтөрү катталган.Мындан тышкары, Toxoplasma gondii дагы бир канцерогендик эффектор болушу мүмкүн жана башка жугуштуу канцерогендерге мээ шишигинин пайда болушуна жардам берүү үчүн синергетикалык иш-аракет кылышы мүмкүн.Бул жагынан алганда, P. falciparum жана Epstein-Barr вирусу Буркитт лимфомасынын пайда болушуна синергетикалык салым кошконун белгилей кетүү керек.
Рак изилдөөлөр тармагында жөнгө салуучу катары экзосомалардын ролу көп изилденген.Бирок, мителердин жана жуккан қожайындардын ортосундагы экзосомалардын ролу начар түшүнүлөт.Буга чейин ар кандай жөнгө салуучулар, анын ичинде жашыруун протеиндер, протозойлордун паразиттеринин кожоюндун чабуулуна каршы туруу жана инфекцияны улантуу биологиялык процесстерин түшүндүрүштү.Акыркы убакта протозойлор менен байланышкан микровезикулалар жана алардын микроРНКлары кабыл алуучу клеткалар менен өз ара аракеттенип, алардын жашоосу үчүн жагымдуу чөйрө түзүлөт деген түшүнүк бар.Ошондуктан, өзгөртүлгөн экзосомалык miRNAs менен глиома клеткаларынын пролиферациясынын ортосундагы байланышты табуу үчүн кошумча изилдөөлөр керек.МикроРНКнын өзгөрүшү (кластердик гендер miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 жана miR-17-92) токсоплазма менен ооруган адамдын макрофагдарындагы STAT3 промоутеру менен байланышат, жөнгө салынат жана анти индукцияланат. Toxoplasma gondii инфекциясына жооп катары -апоптоз 29 .Toxoplasma жугуштуу бир нече hyperproliferative оорулар 30 менен байланышкан miR-17-5p жана miR-106b-5p, сөздү жогорулатат.Бул маалыматтар Toxoplasma инфекциясы менен жөнгө салынган кабыл алуучу miRNAs паразиттердин жашоосу жана кабыл алуучу биологиялык жүрүм-турумунун патогенези үчүн маанилүү молекулалар экенин көрсөтүп турат.
Өзгөртүлгөн miRNAs зыяндуу клеткалардын, анын ичинде глиомалардын башталышы жана прогресси учурунда жүрүм-турумдун ар кандай түрлөрүнө таасир этиши мүмкүн: өсүү сигналдарынын өзүн-өзү камсыз кылуусу, өсүүгө бөгөт коюучу сигналдарга сезгичтик, апоптоздон качуу, чексиз репликативдик потенциал, ангиогенез, инвазия жана метастаз жана сезгенүү.Глиомада өзгөртүлгөн miRNAs бир нече экспрессия профилин изилдөөдө аныкталган.
Бул изилдөөдө биз токсоплазма жуккан кабыл алуучу клеткаларда miRNA-21 экспрессиясынын жогорку деңгээлин тастыктадык.miR-21 катуу шишиктерде эң көп экспрессияланган микроРНКлардын бири катары аныкталган, анын ичинде глиомалар, 33 жана анын экспрессиясы глиоманын даражасына дал келет.Топтолгон далилдер miR-21 жаңы онкоген экенин көрсөтүп турат, ал глиоманын өсүшүндө анти-апоптотикалык фактор катары иш алып барат жана адамдын мээсинин залалдуу шишиктеринин ткандарында жана плазмасында өтө ашыкча экспрессияланат.Кызыктуусу, miR-21 глиома клеткалары менен ткандарындагы инактивациясы каспазага көз каранды апоптоздун натыйжасында клетканын көбөйүшүнө бөгөт коёт.miR-21 алдын ала максаттуу биоинформатикалык талдоо апоптоз жолдору менен байланышкан бир нече шишик басуучу гендерди, анын ичинде программаланган клетка өлүмү 4 (PDCD4), тропомиозин (TPM1), PTEN жана айры куту O1 (FoxO1), miR-2121 милдеттүү сайты менен ачып берди..22.38.
FoxO1, транскрипция факторлорунун (FoxO) бири катары, адам рагынын ар кандай түрлөрүн өнүктүрүүгө катышат жана p21, p27, Bim жана FasL40 сыяктуу шишик басуучу гендердин экспрессиясын жөнгө сала алат.FoxO1 клетканын өсүшүн басуу үчүн p27 сыяктуу клетка циклинин ингибиторлорун байлап, иштете алат.Мындан тышкары, FoxO1 PI3K/Akt сигнализациясынын негизги эффектору болуп саналат жана p2742 транскрипциясын активдештирүү аркылуу клетка циклинин прогресси жана клетка дифференциациясы сыяктуу көптөгөн биологиялык процесстерди жөнгө салат.
Жыйынтыктап айтканда, Toxoplasma жуккан микроглиядан алынган экзосомалык miR-21 глиома клеткаларынын өсүү регулятору катары маанилүү ролду ойной алат (сүрөт 7).Бирок, экзосомалык miR-21, өзгөргөн Toxoplasma инфекциясы жана глиоманын өсүшүнүн ортосунда түз байланышты табуу үчүн кошумча изилдөөлөр керек.Бул жыйынтыктар Toxoplasma жугуштуу жана глиома оорусунун ортосундагы мамилени изилдөө үчүн баштапкы чекит болуп саналат деп күтүлүүдө.
Бул изилдөөдө глиоманын (мээнин) канцерогенезинин механизминин схемалык диаграммасы сунушталган.Автор PowerPoint 2019 программасында тартат (Microsoft, Redmond, WA).
Бул изилдөөдөгү бардык эксперименталдык протоколдор, анын ичинде жаныбарларды колдонуу, Сеул Улуттук университетинин жаныбарларга кам көрүү жана колдонуучу комитетинин этикалык эрежелерине ылайык келген жана Сеул Улуттук университетинин Медицина мектебинин Институттук кароо кеңеши тарабынан бекитилген (IRB номери SNU- 150715).-2).Бардык эксперименталдык процедуралар ARRIVE сунуштарына ылайык жүргүзүлдү.
BV2 чычкан микроглиясы жана U87 адамдын глиома клеткалары Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) жана Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), тиешелүүлүгүнө жараша, ар биринде 10% түйүлдүктүн сывороткасы, 4 ммл камтыган. глутамин, 0,2 мм пенициллин жана 0,05 мм стрептомицин.Клеткалар 37°С температурада 5% СО2 менен инкубатордо өстүрүлдү.Башка глиома клетка линиясы, U118, U87 клеткалары менен салыштыруу үчүн колдонулган.
T. gondii жуккан RH жана ME49 штаммдарынан экзосомаларды бөлүп алуу үчүн T. gondii tachyzoites (RH штамы) 3-4 күн мурун сайылган 6 жумалык BALB/c чычкандардын курсак көңдөйүнөн алынган.Тахизоиттер үч жолу PBS менен жуулду жана 40% Перколлдо (Сигма-Олдрих, Сент-Луис, МО, АКШ)43 центрифугалоо жолу менен тазаланды.ME49 штаммынын тахизоиттерин алуу үчүн BALB/c чычкандарына 20 ткань кистасы интраперитоналдык инъекцияланган жана кисталардагы тахизоит трансформациясы инфекциядан кийин 6-8-күнү ич көңдөйүн жууп чогултулган (PI).PBS менен ооруган чычкандар.ME49 тахизоиттери 100 мкг/мл пенициллин (Gibco/BRL, Гранд-Айленд, NY, АКШ), 100 мкг/мл стрептомицин (Gibco/BRL) жана 5% түйүлдүктүн сывороткасы (Лонза, Уолкерсвилл, MD) менен толукталган клеткаларда өстүрүлгөн. .., АКШ) 37 °C жана 5% көмүр кычкыл газы.Веро клеткаларында өстүргөндөн кийин, ME49 тахизоиттери калдыктарды жана клеткаларды жок кылуу үчүн 25 калибрлүү ийнеден, андан кийин 5 мкм фильтрден эки жолу өткөрүлдү.Жуулгандан кийин тахизоиттер PBS44 менен кайрадан суспензияланган.Toxoplasma gondii ME49 штаммынын кыртыш кисталары инфекцияга чалдыккан C57BL/6 чычкандарынын (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Корея) мээсинен бөлүнүп алынган кисталарды ичке инъекциялоо жолу менен сакталган.ME49 жуккан чычкандардын мээси PI 3 айдан кийин жыйналып, кисталарды бөлүп алуу үчүн микроскоп астында майдаланган.Ооруга чалдыккан чычкандар Сеул Улуттук Университетинин Медицина мектебинде атайын патогенсиз шарттарда (SPF) сакталган.
Жалпы РНК BV2ден алынган экзосомалардан, BV2 клеткаларынан жана кыртыштардан miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия) аркылуу өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык, анын ичинде элюция кадамы үчүн инкубация убактысына ылайык алынган.РНК концентрациясы NanoDrop 2000 спектрофотометринде аныкталган.РНК микроэлементтеринин сапаты Agilent 2100 биоанализери (Agilent Technologies, Amstelveen, Нидерланды) аркылуу бааланган.
10% экзосомасы начар FBS менен DMEM 100,000 г 16 саат бою 4°Cде ультрацентрифугалоо жолу менен даярдалды жана 0,22 мкм фильтрден (Налгене, Рочестер, Нью-Йорк, АКШ) чыпкаланды.BV2 клеткалары, 5 × 105, 37 ° C жана 5% СО2 10% exosome-жойгон FBS жана 1% антибиотиктерди камтыган DMEM менен өстүрүлгөн.24 саат инкубациялоодон кийин, RH же ME49 штаммынын тахизоиттери (MOI = 10) клеткаларга кошулуп, бир сааттын ичинде инвазиясыз мителер алынып салынды жана кайра DMEM менен толтурулду.BV2 клеткаларынан экзосомалар эң кеңири колдонулган ыкма болгон модификацияланган дифференциалдык центрифугалоо жолу менен бөлүнүп алынган.РНК же протеин талдоо үчүн 300 мкл PBS менен exosome pellet resuspend.Бөлүнгөн экзосомалардын концентрациясы BCA протеин анализинин комплекти (Пирс, Рокфорд, IL, АКШ) жана NanoDrop 2000 спектрофотометри аркылуу аныкталган.
BV2 клеткаларынан алынган чөкмөлөр же BV2ден алынган экзосомалар PRO-PREP™ протеинди экстракциялоочу эритмесинде (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Корея) лизистелген жана белоктор Coomassie жаркыраган көк түстөгү 10% SDS полиакриламиддик гелдерине жүктөлгөн.Мындан тышкары, белоктор PVDF мембраналарына 2 саатка которулду.Батыш тактары Аликс антителосун (Cell Signaling Technology, Беверли, MA, АКШ) экзосомалык маркер катары колдонуу менен текшерилди.HRP-конъюгацияланган теке чычканга каршы IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Монтгомери, TX, АКШ) жана LAS-1000 плюс люминесценттик сүрөт анализатору (Fuji Photographic Film, Токио, Япония) экинчи антитело катары колдонулган..Экзосомалардын өлчөмүн жана морфологиясын изилдөө үчүн трансмиссиялык электрондук микроскопия жасалган.BV2 клеткаларынан бөлүнүп алынган экзосомалар (6,40 мкг/мкл) көмүртек капталган торчолорго даярдалып, 2% уранилацетат менен 1 мүнөткө терс боелгон.Даярдалган үлгүлөр ES1000W Erlangshen CCD камерасы менен жабдылган JEOL 1200-EX II (Токио, Япония) (Гатан, Плеасантон, CA, АКШ) менен 80 кВ тездетүүчү чыңалууда байкалган.
BV2 алынган экзосомалар PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Oldrich, Сент-Луис, МО, АКШ) менен бөлмө температурасында 15 мүнөткө боёлгон.U87 клеткалары, 2 × 105, PKH26 менен белгиленген экзосомалар (кызыл) же терс контроль катары экзосомалар жок, 37°C температурада 5% СО2 инкубаторунда 24 саат бою инкубацияланган.U87 клетка ядролору DAPI (көк) менен боёлуп, U87 клеткалары 4% параформальдегидде 4°Cде 15 мүнөткө бекитилип, андан кийин Leica TCS SP8 STED CW конфокалдык микроскоп системасында талданышты (Leica Microsystems, Mannheim, Германия).байкоого болот.
cDNA Mir-X siRNA биринчи катар синтези жана SYBR qRT-PCR комплекти (Takara Bio Inc., Shiga, Япония) аркылуу siRNAдан синтезделген.Реалдуу убакыттагы сандык ПТР SYBR Premix менен аралаштырылган праймерлерди жана шаблондорду колдонуу менен iQ5 реалдуу убакыт ПТР аныктоо тутумун (Bio-Rad, Hercules, CA, АКШ) колдонуу менен аткарылган.ДНК денатурациянын 40 циклы үчүн 95°Cде 15 секундга жана 60°Cде 60 секунда күйдүрүү үчүн күчөтүлгөн.Ар бир ПТР реакциясынын маалыматтары iQ™5 оптикалык тутумунун программалык камсыздоосунун (Bio-Rad) маалыматтарды талдоо модулунун жардамы менен талданды.Тандалган максаттуу гендер менен β-актин/siRNA (жана U6) ортосундагы ген экспрессиясындагы салыштырмалуу өзгөрүүлөр стандарттык ийри сызык ыкмасы менен эсептелген.Колдонулган праймер ырааттуулугу 1-таблицада көрсөтүлгөн.
3 x 104 U87 глиома клеткалары 96 көзөнөктүү плиталарга себилген жана BV2ден (50 мкг/мл) алынган токсоплазманы жуктурган экзосомалар же BV2ден (50 мкг/мл) алынган импульстук эмес экзосомалар менен 12, 18 жана 36 сааттарда башкаруу элементтери катары аралаштырылды. .Клетканын көбөйүү ылдамдыгы Cell Counting Kit-8 (Дожиндо, Кумамото, Япония) (Кошумча фигуралар S1-S3) 46 аркылуу аныкталган.
5 жумалык ургаачы BALB/c жылаңач чычкандар Orient Bioдан (Сонгнам-си, Түштүк Корея) сатылып алынган жана бөлмө температурасында (22 ± 2 ° C) жана нымдуулукта (45 ± 15 ° C) стерилдүү клеткаларда жекече сакталган.%) бөлмө температурасында (22±2°C) жана нымдуулукта (45±15%).12 сааттык жарык цикли жана 12 сааттык караңгы цикл SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center) алкагында аткарылган.Чычкандар туш келди үч топко бөлүнүп, ар бири 5 чычкандан турган жана бардык топторго 1 x 107 U87 глиома клеткалары жана өсүү фактору төмөндөгөн BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, АКШ) камтыган 400 мл PBS тери астына сайылган.Шишик инъекциясынан алты күндөн кийин BV2 клеткаларынан алынган 200 мг экзосомалар (токсоплазма инфекциясы бар/болбогон) шишиктин аймагына сайылган.Шишик инфекциясынан жыйырма эки күн өткөндөн кийин, ар бир топтогу чычкандардын шишик өлчөмү жумасына үч жолу штангенциркуль менен ченелип, шишиктин көлөмү формула боюнча эсептелген: 0,5 × (туурасы) × 2 × узундук.
miRCURYTM LNA miRNA массивинин жардамы менен MicroRNA экспрессиясын талдоо, 7-муунга ээ, mmu жана rno массивдери (EXIQON, Vedbaek, Дания) 3100 адам, чычкан жана келемиш миРНКны кармоо зондунун арасында 1119 жакшы мүнөздөлгөн чычкандарды камтыйт.Бул процедуранын жүрүшүндө 250дөн 1000 нгге чейин жалпы РНК 5′-фосфаттан музоо ичегисинин щелочтуу фосфатазасы менен дарылоодон кийин Hy3 жашыл флуоресценттик боёк менен маркировкалоо аркылуу алынып салынды.Андан кийин маркировкаланган үлгүлөр гибриддештирүү камерасынын комплекти (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, АКШ) жана гибриддештирүү слайд комплекти (Agilent Technologies) аркылуу микроаррей слайддарын жүктөө аркылуу гибриддешти.Гибриддештирүү 16 саат бою 56°С температурада жүргүзүлдү, андан кийин микроаррейлер өндүрүүчүнүн сунуштарына ылайык жуулду.Андан кийин иштетилген микроаррей слайддары Agilent G2565CA микроаррей сканер системасы (Agilent Technologies) аркылуу сканерден өткөрүлдү.Сканерленген сүрөттөр Agilent Feature Extraction программалык версиясынын 10.7.3.1 (Agilent Technologies) жардамы менен импорттолгон жана ар бир сүрөттүн флуоресценция интенсивдүүлүгү өзгөртүлгөн Exiqon протоколунун тиешелүү GAL файлы аркылуу сандык бааланган.Учурдагы изилдөө үчүн микроаррей маалыматтары GPL32397 кошулуу номери менен GEO маалымат базасына сакталган.
Токсоплазма менен жуккан RH же ME49 штаммдарынын микроглияларындагы жетилген экзосомалык miRNAлардын экспрессия профилдери ар кандай тармак куралдарын колдонуу менен талданды.шишиктин өнүгүшү менен байланышкан miRNAs miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) аркылуу аныкталган жана нормалдаштырылган сигнал интенсивдүүлүгү (log2) 8.0 жогору менен чыпкаланган.miRNAs арасында дифференциалдуу экспрессияланган miRNAs T. gondii менен жуккан RH же ME49 штаммдары менен өзгөртүлгөн миРНКлардын чыпкалуу анализи аркылуу 1,5 эседен ашык өзгөргөндүгү аныкталган.
Клеткалар Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, АКШ) колдонуу менен opti-MEM (Гибко, Карлсбад, CA, АКШ) алты-кудук пластиналарга (3 х 105 клетка/кудук) себилген.Трансфекцияланган клеткалар 6 саат бою культурацияланган жана андан кийин чөйрө жаңы толук чөйрөгө алмаштырылган.Клеткалар трансфекциядан кийин 24 сааттан кийин жыйналды.
Статистикалык талдоо негизинен Excel программасы менен Студенттин t-тестинин жардамы менен жүргүзүлдү (Microsoft, Вашингтон, ДС, АКШ).Эксперименталдык жаныбарларды талдоо үчүн Prism 3.0 программасын (GraphPad Software, La Jolla, CA, АКШ) колдонуу менен эки тараптуу ANOVA жүргүзүлгөн. P-маанилери < 0,05 статистикалык жактан маанилүү деп эсептелген. P-маанилери < 0,05 статистикалык жактан маанилүү деп эсептелген. Значения P <0,05 считались статистически значимими. P <0,05 маанилери статистикалык мааниге ээ болгон. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимими. P <0,05 маанилери статистикалык мааниге ээ болгон.
Бул изилдөөдө колдонулган бардык эксперименталдык протоколдор Сеул улуттук университетинин медицина мектебинин (IRB саны SNU-150715-2) Институттук кароо кеңеши тарабынан бекитилген.
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. жана башкалар.2018-жылы болжолдуу глобалдык рак оорусу жана өлүм: GLOBOCAN булактары жана ыкмалары.интерпретация.Дж. Рак 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Мээ шишигинин тобокелдик факторлору жана алардын терапиялык кийлигишүүлөрү жөнүндө түшүнүк. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Мээ шишигинин тобокелдик факторлору жана алардын терапиялык кийлигишүүлөрү жөнүндө түшүнүк.Rashid, S., Rehman, K. жана Akash, MS Мээ шишиги жана негизги терапиялык кийлигишүү үчүн тобокелдик факторлорун карап чыгуу. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Мээ шишигинин тобокелдик факторлорун жана терапиялык кийлигишүүлөрдү терең түшүнүү.Rashid, S., Rehman, K. жана Akash, MS Мээ шишиги жана негизги терапиялык кийлигишүү үчүн тобокелдик факторлорун карап чыгуу.Биомедициналык илим.Фармацевт.143, 112119 (2021).
Като, I., Zhang, J. & Sun, J. Адамдын тамак-аш жана аял жыныс органдарынын рак оорусунда бактериялык-вирустук өз ара аракеттенүү: эпидемиологиялык жана лабораториялык далилдердин кыскача баяндамасы. Като, I., Zhang, J. & Sun, J. Адамдын тамак-аш жана аял жыныс органдарынын рак оорусунда бактериялык-вирустук өз ара аракеттенүү: эпидемиологиялык жана лабораториялык далилдердин кыскача баяндамасы.Като I., Чжан Дж. жана Сун Дж. Адамдын ичеги-карын трактынын жана аялдардын жыныс органдарынын рак оорусунда бактериялык-вирустук өз ара аракеттенүүсү: эпидемиологиялык жана лабораториялык маалыматтардын кыскача баяндамасы. Като, И., Чжан, Дж. & Сун, Дж. Като, I., Zhang, J. & Sun, J. адамдын оозеки сиңирүү жана аялдардын репродуктивдүү трактындагы бактерио-вирустук өз ара аракеттенүү: популярдуу оору илиминин жана лабораториялык далилдердин кыскача баяндамасы.Като I., Zhang J. жана Sun J. Адамдын ичеги-карын рагы жана аялдардын жыныстык рак оорусунда бактериялык-вирустук өз ара аракеттенүү: эпидемиологиялык жана лабораториялык маалыматтардын кыскача баяндамасы.Рак 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Инфекциядан ракка чейин: ДНК шишик вирустары клетканын борбордук көмүртек жана липиддердин алмашуусун кантип өзгөртөт. Magon, KL & Parish, JL Инфекциядан ракка чейин: ДНК шишик вирустары клетканын борбордук көмүртек жана липиддердин алмашуусун кантип өзгөртөт.Mahon, KL жана Parish, JL Рак оорусуна каршы инфекция: ДНКга негизделген шишик вирустары клетканын борбордук көмүртек жана липиддердин алмашуусун кантип өзгөртөт. Magon, KL & Parish, JL. Magon, KL & Parish, JL Инфекциядан ракка чейин: ДНК шишик вирустары клетканын борбордук көмүртек жана липиддердин алмашуусун кантип өзгөртөт.Mahon, KL жана Parish, JL рак оорусуна каршы инфекция: ДНК шишик вирустары кабыл алуучу клеткалардагы борбордук көмүртек жана липиддик метаболизмди кантип өзгөртөт.Ачык биология.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Шистосомалардын катехол эстрогендери жана боор фликтери жана гельминт менен байланышкан рак.алдыңкы.ичи ысык.5, 444 (2014).