Лямблия он эки эли ичеги - бул лямблиозду, өзгөчө диареянын клиникалык белгилери менен жаш балдарда кеңири таралган ичеги инфекциясын пайда кылган мите организм.Биз мурда клеткадан тышкаркы G. duodenalis клетка ичиндеги oligomerization сыяктуу кабылдагыч 3 (NLRP3) байланыштыруучу нуклеотиддердин жандануусун козгойт жана клеткадан тышкаркы везикула (EV) секрециясы аркылуу кабыл алуучу сезгенүү жооп жөнгө деп билдирди.Бирок, бул жараянга тартылган патоген менен байланышкан duodenococcal EV (GEV) так молекулярдык үлгүлөрү жана лямблиоздо NLRP3 inflammasome ролу дагы эле тактала элек.
GEVдеги рекомбинантты эукариоттук экспрессия плазмидалары pcDNA3.1(+)-alpha-2 жана alpha-7.3 лямбиндер түзүлүп, чычкандын негизги перитонеалдык макрофагдарына трансфекцияланган жана сезгенүүнүн максаттуу молекуласы каспас-1ди өлчөө жолу менен аныкталган.p20 экспрессия деңгээли экрандан өткөрүлдү..G. duodenalis Alpha-2 жана Alpha-7.3 лямбдиндери алгач NLRP3 inflammasome (NLRP3, про-интерлейкин-1 бета [IL-1β], про-каспаза-1 жана каспас-1 p20), IL секрециясын өлчөө жолу менен аныкталган.1β деңгээли, апоптотикалык так протеин (ASC) олигомеризация деңгээли жана NLRP3 жана ASCтин иммунофлуоресценттик локализациясы.G. duodenalisтин патогендүүлүгүндө NLRP3 inflammasome ролу андан кийин NLRP3 активдештирүү бөгөттөлгөн чычкандардын жардамы менен бааланган (NLRP3 бөгөттөлгөн чычкандар) жана дене салмагындагы, он эки эли ичегидеги мителердин жүгүндөгү жана он эки эли ичегинин тканындагы патологиялык өзгөрүүлөргө мониторинг жүргүзүлгөн.Мындан тышкары, биз hiardines alpha-2 жана alpha-7.3 NLRP3 inflammasome аркылуу in vivo IL-1β секрециясын түрткү же жокпу, изилдеп, чычкандардын G. duodenalis патогендүүлүгүн бул молекулалардын ролун аныктады.
Alpha-2 жана Alpha-7.3 лямбдиндер in vitro NLRP3 inflammasome активдештирүүгө түрткү берет.Бул p20 caspase-1 активдештирилишине, NLRP3, pro-IL-1β жана pro-caspase-1 протеиндердин экспрессия деңгээлинин жогорулашына, IL-1β секрециясынын олуттуу өсүшүнө, денеде ASA тактарынын пайда болушуна алып келди. цитоплазма жана ASA олигомеризациясынын индукциясы.NLRP3 сезгенүүсү Penile жоготуу чычкандардын G. duodenalis патогендүүлүгүн күчөтөт.NLRP3 бөгөттөлгөн чычкандардан гаваж аркылуу кисталар менен дарыланган чычкандарда трофозоиттердин көбөйүшү жана он эки эли ичегинин вилласынын катуу жабыркашы байкалган, алар кичирейген жана бутактанган некротикалык крипттер менен мүнөздөлөт.In vivo эксперименттер лямбдиндер alpha-2 жана alpha-7.3 NLRP3 inflammasome аркылуу IL-1β секрециясын түрткү бере аларын көрсөттү, ал эми лямбдиндер alpha-2 жана alpha-7.3 менен иммундаштыруу G. duodenalis чычкандардын патогендүүлүгүн азайткан.
Чогуу алганда, бул изилдөөнүн натыйжалары лямблия альфа-2 жана альфа-7.3 лямблиоздун алдын алуу үчүн келечектүү максаттар болуп саналган чычкандардын NLRP3 сезгенүүсүнүн жогорулашын жана G. duodenalisтин жугуштуулугун төмөндөтөт.
Giardia duodenum – бул ичке ичегиде жашаган клеткадан тышкаркы жөнөкөй паразит жана жыл сайын 280 миллион лямблиоз оорусун диарея менен, өзгөчө өнүгүп келе жаткан өлкөлөрдө жаш балдардын арасында пайда кылат [1].Адамдар он эки эли ичегинин кистасы менен булганган ичүүчү суудан же тамак-аштан жугуп, андан кийин ашказанга кирип, ашказан ширеси менен бөлүнүп чыгат.Лямблия он эки эли ичегинин трофозоиттери он эки эли ичегинин эпителийине жабышып, жүрөк айлануу, кусуу, диарея, ичтин оорушу жана арыктоо сыяктуу ооруларды пайда кылат.Иммундук жетишсиздиги жана муковисцидозу бар адамдар инфекцияга кабылышат.Инфекция оралдык жана аналдык секс аркылуу да болушу мүмкүн [2].Метронидазол, тинидазол жана нитазоксанид сыяктуу дарылар он эки эли ичегинин инфекциясын дарылоонун артыкчылыктуу варианттары болуп саналат [3].Бирок, бул химиотерапия препараттары жүрөк айлануу, канцерогенез жана генотоксиктик сыяктуу терс таасирлерди жаратат [4].Ошондуктан, G. duodenalis инфекциясын алдын алуу үчүн кыйла натыйжалуу стратегияларды иштеп чыгуу керек.
Inflammasomes патогендик инвазиядан коргонууга жана сезгенүү реакцияларына ортомчулук кылууга жардам берүүчү тубаса иммундук жооптун бир бөлүгү болгон цитозолдук белок комплекстеринин классы болуп саналат [5].Бул inflammasomes арасында нуклеотид-байланыштуу олигомеризация (NOD) 3-рецептор (NLRP3) нуклеотид-байланыштуу олигомеризация (NLRP3) нуклеотид-байланыштуу сыяктуу сезгенүү көп изилденген, анткени ал ар кандай патоген/зыян-ассоциацияланган PAMP үлгүлөрү менен аныкталышы мүмкүн. DAMP), тубаса иммундук системаны тааныйт, активдештирет.жана көптөгөн сезгенүү ооруларында ичеги гомеостазын жөнгө салат [6,7,8].Ал үлгү таануу кабылдагычынан (PRR) NLRP3, адаптер апоптотикалык так белок (ASC) жана эффектордук прокаспаза-1 же прокаспаза-11ден турат.NLRP3 inflammasome Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] жана Leishmania изилдөөлөрүндө байкалгандай, патогендик инвазияга каршы хост катары иштейт.[11], бирок ошондой эле NLRP3 inflammasome активдештирүү коргоочу иммундук жоопторду чектеп, оорунун өрчүшүн күчөтөт, мисалы, курттарда [12].Биздин мурунку табылгаларыбыздын негизинде, биз клеткадан тышкаркы G. duodenalis NLRP3 сезгенүүсүнүн клетка ичиндеги активдештирүүсүн жана клеткадан тышкаркы везикулаларды (EVs) бөлүп чыгаруу менен кабыл алуучу сезгенүү реакцияларын модуляциялай турганын билдирдик [13].Бирок, in vivo G. duodenalis инфекциясында NLRP3 inflammasome ролу дагы эле аныктала элек.
Лямардиндер алгач G. duodenalis цитоскелетинин структуралык компоненттери катары сүрөттөлгөн жана ичке ичегидеги трофозоит кыймылдуулугунда жана эпителий клеткаларынын жабышылышында маанилүү роль ойнойт.Айлана-чөйрөгө жакшы ыңгайлашуу жана алардын патогендүүлүгүн жогорулатуу үчүн G. duodenalis trophozoites 8 желектен, 1 ортоңку денеден жана 1 вентралдык дисктен турган уникалдуу цитоскелет түзүлүшүн иштеп чыгышкан [14].Giardia duodenum трофозоиттери өздөрүнүн цитоскелети аркылуу жогорку ичке ичегиге, өзгөчө он эки эли ичегиге кирип, энтероциттерге жабышат.Алар тынымсыз көчүп, клетканын метаболизмин колдонуп эпителий клеткаларына жабышат.Демек, алардын цитоскелети менен вируленттүүлүгүнүн ортосунда тыгыз байланыш бар.Giardia duodenum үчүн спецификалык лямбдиндер цитоскелет структурасынын компоненттери болуп саналат [15] жана төрт класска бөлүнөт: α-, β-, γ- жана δ-лямблиялар.α-лямбярдин үй-бүлөсүнүн 21 мүчөсү бар, алардын баары фосфолипиддерди байланыштыруу үчүн кальцийге көз каранды жөндөмгө ээ [16].Алар ошондой эле цитоскелетти клетка мембранасы менен байланыштырат.G. duodenalis менен шартталган ич өткөк менен ооруган адамдарда α-лямбардиндер инфекция учурунда өтө экспрессиялуу жана иммунореактивдүү болот [17].Giardia alfa-1 негизиндеги гетерологиялык вакциналар чычкандардын лямблиозунан корголгон жана вакцинаны иштеп чыгуу үчүн потенциалдуу талапкер антигендер болуп саналат [18].Альфа-8 гиардин, плазмалык мембранада жана желекчеде локализацияланган, бирок вентралдык дискте эмес, G. duodenalisтеги трофозоиттердин кыймылдуулугун жана өсүү темпин жогорулатат [19].Альфа-14 гиардин флагелладагы микротүтүкчөлөргө жабышып, G. duodenalisтин жашоо жөндөмдүүлүгүнө таасирин тийгизет [20].Альфа-11 лямбдин жашоо циклинде көп кездешет жана альфа-11 лямбдиндин ашыкча экспрессиясы G. duodenalisтин өзүнө зыян келтирет [21].Бирок, альфа-2 гиардин жана альфа-7,3 гиардин G. duodenalis инфекциясынан жана алардын негизги механизмдеринен коргойбу же жокпу, белгисиз.
Бул изилдөөдө рекомбинантты эукариоттук экспрессия плазмиддери pcDNA3.1 (+) -alpha-2 ляардин жана pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 ляардин NLRP3 ээсин активдештирүү үчүн чычкандын негизги перитонеалдык макрофагдарына трансфекцияланган.Андан кийин сезгенүү максаттары текшерилди.Биз ошондой эле G. duodenalisтин патогендүүлүгүндө NLRP3 inflammasome ролуна баа бердик, альфа-2 жана альфа-7,3 лямбарддардын in vivo NLRP3 inflammasome активдештирүүсүн иликтедик жана лямбилдин бул эки ролунун патогендүүлүгүн аныктадык. G. duodenalis.Биздин жалпы максатыбыз G. duodenalis инфекциясынын алдын алуу боюнча келечектүү максаттарды иштеп чыгуу болгон.
Жапайы типтеги (WT) C57BL/6 ургаачы чычкандары 5–8 жумалык Лиаонин Чаншенг эксперименталдык жаныбарлар борборунан (Ляонин, Кытай) сатылып алынган.Чычкандар сууга эркин кире алышкан, стерилденген тамактарды алышкан жана 12/12 сааттык жарык/караңгы циклде кармашкан.Инфекцияга чейин чычкандар ампициллин (1 мг/мл), ванкомицин (1 мг/мл) жана неомицин (1,4 мг/мл) кошулган ичүүчү сууга антибиотиктерди ad libitum алышкан (баары Шанхайдан, Кытайдан сатып алынган, жасалма организмдер) [22] ].].24 сааттан ашык жеп-ичүү жөндөмүн жоготкон жана дене салмагынын ≥ 20% жоготкон чычкандар жатын моюнчасынын дислокациясы аркылуу эвтанизацияланган.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) 12,5% түйүлдүктүн сывороткасы (FBS; Every Green, Zhejiang, Кытай) жана 0,1% бодо өт (Сигма-Олдрих, Сент-Миссури, АКШ) менен толукталган. ).АКШ) микроаэробдук шарттарда.Кошулган трофозоиттер муз үстүндө чогултулуп, андан ары көбөйүү үчүн 1:4 пропорциясында өткөрүлдү.
Лямблия он эки эли ичеги кисталары мурда сүрөттөлгөндөй индукцияланган [23], трофозоиттер логарифмдик фазада жыйналып, андан кийин рН 7,1 (модифицирленген TYI-S-33) 1 × 106 трофозоит/мл акыркы концентрацияга чейин инкапсуляциялоочу чөйрө менен суюлтулган.өт концентрациясы 0,05% орто).Трофозоиттер анаэробдук шарттарда 37°С логарифмдик өсүү фазасына чейин өстүрүлгөн.Киста индукциялоочу чөйрөгө (рН 7,8; ​​1% өт концентрациясы менен өзгөртүлгөн TYI-S-33 чөйрөсүнө) жана G. duodenalis маданиятын 37°C 48–96 саатка өзгөртүңүз, анын жүрүшүндө микроскоптун астында калыптанган кисталар байкалды.Трофозоиттердин көбү кисталарды пайда кылуу үчүн индукциялангандан кийин, культура аралашмасы жыйналып, калган трофозоиттерди лизис үчүн стерилдүү деионизацияланган сууга кайра суспензияланган.Цисталар эсептелип, чычкандардын ашказан түтүгү аркылуу кийинки анализдер үчүн 4°Cде сакталган.
Лямблия клеткадан тышкары весикулалар (GEVs) мурда [13] сүрөттөлгөндөй байытылган.Логарифмдик өсүү фазасындагы трофозоиттер экзосомасы азайып кеткен FBS (Biological Industries, Бейт-Хаемек, Израиль) менен даярдалган модификацияланган TYI-S-33 чөйрөсүндө 1 × 106 паразит/мл акыркы концентрациясына чейин кайра токтотулду жана 12 саатка инкубацияланды.2000 г 10 мүнөт, 10 000 г 45 мүнөт жана 100 000 г 60 мүнөт центрифугалоо жолу менен маданияттын үстүнкү заттан бөлүнүп алынган.Чөкмөлөр фосфаттык буфердик тузда (PBS) эриди, BCA протеинди анализдөө комплекти (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, АКШ) аркылуу өлчөнөт жана -80°Cде сакталды же андан аркы анализдер үчүн түздөн-түз колдонулат.
Баштапкы чычкандын перитонеалдык макрофагдары мурда [24] сүрөттөлгөндөй даярдалган.Кыскача айтканда, чычкандарга (6-8 жумалык) 2,5 мл 2,98% Difco суюк тиогликол чөйрөсү (BD, Franklin Lakes, NJ, АКШ) сайылып (интраперитоналдык [ip]) жана 3-4 таңдай тамактандырылды.Макрофагдардын суспензиясы эвтаназиядан кийин чычкандардын курсак көңдөйүнөн чогултулуп, 3 жолу 1000 г центрифугада 10 мүнөт.Жыйналган клеткалар CD11b маркеринин жардамы менен клетканын тазалыгы >98% болгонго чейин агымдык цитометрия аркылуу аныкталган, андан кийин 6-уячалуу клетка маданият плиталарына (4,5 х 106 клетка/кудук) кошулган жана 37°Cде 10% FBS (Bioindustry) менен инкубацияланган.жана 5% CO2.
РНК 1 мл ТРИзол реагентинде 1 × 107 трофозоиттен алынган (Вазыме, Нанкин, Кытай), геномдук ДНК жалпы G. duodenalis РНКсынан MonScript dsDNase (Монад, Вухан, Кытай) аркылуу алынган жана комплементарлык ДНК (cDNA) синтезделген. өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык MonScript RTIIII Super Mix (Monad) колдонуу.
Максаттуу G. duodenalis гени үчүн CDS ырааттуулугу тууралуу маалымат NCBI GenBankтан алынган.Ар бир максаттуу ген үчүн атайын кемчиликсиз клондоочу праймерлерди иштеп чыгуу үчүн Primer 5.0 колдонуңуз.Алдыдагы праймер (5′-3′) үч бөлүктөн турат: сызыктуу pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) сызыктуу вектору жана ATG жана GNN кодондорун баштоо (эгерде биринчи база G болбосо) менен бири-бирине дал келген ырааттуулук.Бул сөздүн натыйжалуулугун жогорулатуу үчүн жасалат.Мындан тышкары, жок эле дегенде, 16 bp бириктирилген негиздери (GC мазмуну 40-60% / Tm болжол менен 55 °C).Тескери праймер (5′-3′) эки бөлүктөн турат, EcoRV-сызыкташтырылган pcDNA3.1(+) вектору (GCCGCCACTGTGCTGGAT) менен кайталанган ырааттуулук жана кеминде 16 б.п.(акыркы эки аялдаманы кошпогондо).негиздер) рекомбинантты плазмиддерге белгиленген белокторду экспрессиялоого мүмкүндүк берүү үчүн AA же GA сыяктуу кодон.Праймер ырааттуулугу 1-таблицада келтирилген жана аларды Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Чанчун, Кытай) синтездеген.
Максаттар Pfu ДНК полимеразасы (Тянген, Пекин, Кытай) же Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Пекин, Кытай) менен даярдалган G. duodenalis cDNAсын калып катары колдонуу менен күчөтүлгөн.Эукариоттук экспрессия векторунун плазмиди pcDNA3.1(+) EcoRV чектөө ферменти менен сызыктуу жана Fast AP (Thermo Fisher Scientific) жардамы менен дефосфоризацияланган.Линеаризацияланган pcDNA3.1(+) фрагменттери жана күчөтүлгөн максаттуу ген фрагменттери ДНК гелин тазалоочу комплект (Тянген) аркылуу тазаланып, Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific) аркылуу сандык аныкталды.pcDNA3.1(+) фрагменти жана ар бир максаттуу ген фрагменти MonClone бирдиктүү монтаждык клондоо аралашмасын колдонуу менен рекомбинацияланган (Monad Biotech Co., Ltd., Сучжоу, Кытай) жана Comate Bioscience Company Limited (Чанчун, Кытай) аркылуу ДНК секвенирлөө жолу менен тастыкталган..
Endotoxin-эркин плазмиддер pcDNA3.1(+)-alpha-2 жана pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 SanPrep Endotoxin-эркин Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech) колдонуу менен түзүлгөн.Элюция буфериндеги EDTA трансфекциялык анализге тоскоол болбошу үчүн концентрация 500 нг/мклден жогору сакталды.Чычкандын перитонеалдык макрофагдары толук RPMI 1640 чөйрөсү (Biological Industries) менен 6 көзөнөктүү пластиналарда 12 саат бою өстүрүлдү, андан кийин пенициллин менен стрептомицинди алып салуу үчүн клеткалар жылуу PBS менен 3 жолу жуулду, андан кийин толук чөйрө менен толукталган.Endotoxin-эркин плазмиддер pcDNA3.1 (+) -alpha-2 жана pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 (2.5 мкг) Opti-MEM кыскарган сыворотка чөйрөсүндө (Gibco, Thermo Fisher Scientific) 125 мкл суюлтулган..Андан кийин 5 мкл Lipofectamine 2000 трансфекциялык реагент (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) 125 мкл аз сывороткадагы Opti-MEM чөйрөсүндө суюлтулган.Суюлтулган эндотоксинсиз плазмидди Lipofectamine 2000 менен аралаштыруу жана аралашма бөлмө температурасында 5 мүнөт турууга мүмкүндүк берүү менен липосома-ДНК комплекстерин даярдаңыз.Комплекстерди ар бир кудуктагы клеткаларга өзүнчө өткөрүп, жай аралаштырыңыз.4 сааттан кийин клетканын маданият чөйрөсү 2 мл толук RPMI 1640 чөйрөсү менен алмаштырылды жана культура 24 саат бою улантылды.Жаңы клетка маданият чөйрөсү клеткаларга кошулуп, анализдин дизайнына жараша ар кандай убакыт чекиттеринде инкубацияланган.
Супернатанттардан жана клетка лизаттарынан белок үлгүлөрү мурда [25] сүрөттөлгөндөй даярдалган.Про-IL-1β, про-caspase-1, каспас-1 p20, NLRP3, β-актин жана His-тег үчүн мембрана өткөрүү параметрлери 200 мА/90 мин болгон.Interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, АКШ), каспас-1 (p20) (Adipogen, Switzerland) жана NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Switzerland) жана 1:5000 үчүн Анын S tagenci (Amylet) багытталган Wuhan, Кытай) жана β-актин (Proteintech, Wuhan, Кытай).
Disuccinimide suberate (DSS) менен кайчылаш байланыш мурда [26] сүрөттөлгөндөй аткарылган.Клеткалар 3 жолу муздак PBS менен жууп, 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES жана 125 мм NaHCO3 камтыган 50 мкл ASC реакция буферинде (рН 8,0) 27 калибрлүү ийне менен толугу менен лизиден өткөрүлдү.Аралашма 5000 г температурада 3 мүнөт центрифугаланган жана гранул 10 мкл DSS (DMSOда 25 мМ) жана 40 мкл ASC реакция буфери менен 37°Cде 30 мүнөткө тигилген.10 мүнөт 5000 г центрифугалоодон кийин, гранул 40 мкл ASC реакция буферинин жана 10 мкл 6x белок жүктөө буферинин эритмесинде (ТрансГен, Пекин, Кытай) эритилди, андан кийин эритме бөлмө температурасында 15 мүнөт өчүрүлдү. мин., Андан кийин 10 мүнөт кайнатыңыз.Протеин үлгүлөрү андан кийин 1:500 суюлтуу катышында негизги анти-АСК антителолорун (Wanleibio, Shenyang, Кытай) колдонуу менен Western blotting дуушар болгон.
Мурда сүрөттөлгөн процедурадан кийин [13], клетка маданиятынын супернатанттары жыйналды жана чычкандын IL-1 Beta ELISA комплекти (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) аркылуу сезгенүүгө каршы цитокин IL-1β секрециясы аныкталган.IL-1β стандарттык ийри сызыгын колдонуп, OD450nm маанилерин протеин концентрациясына айландырыңыз.
Капталдарга капталган клеткалар жылуу PBS менен 3 жолу акырын жууп, ткань клеткасынын фиксаторуна (Biosharp, Пекин, Кытай) 10 мүнөт бөлмө температурасында (RT), 0,1% Triton X-Permeabilize 100 (PBS менен суюлтулган; Biosharp) менен жуушту. ) бөлмө температурасында 20 мүнөткө жана бөлмө температурасында 2 саат бою 5% бодо малдын сывороткасындагы альбуминге (ПБСте) бөгөт коюу.Андан кийин клеткалар ASC (1:100 суюлтуу) же NLRP3 (1:100 суюлтуу) жана Cy3 менен белгиленген эчкиге каршы коёнго каршы IgG(H+L) (1:400; EarthOx) менен биринчилик антителолор менен 4°C түнү менен инкубацияланган. , San Francisco, CA, USA) же FITC-конъюгацияланган теке чычканга каршы IgG (1:400; Earthox) түнү 37°C караңгыда 1 саат.Ядролор Hoechst 33258 (10 мкг/мл; UE, Сучжоу, Кытай) менен 5 мүнөт бою боёлуп, флуоресценттик микроскоптун астында байкалган (Olympus Corporation, Токио, Япония).
Чычкандар төрт топко бөлүнгөн (ар бир топто n = 7): (i) PBS менен дарылоодон өткөн терс башкаруу тобу (PBS гана; 100 мкл/чычкан PBS гаваж, андан кийин күн сайын 100 мкл/чычкан PBS 3 сааттан кийин ичке инъекция)., үзгүлтүксүз 7 күн бою);(ii) терс башкаруу тобу MCC950 ингибитору [27] (PBS гаваж аркылуу 100 мкл/чычкан, 3 сааттан кийин, 10 мг/кг дене салмагын [BW] MCC950 [PBS менен] күн сайын интраперитоналдык түрдө, узактыгы 7 күн);(iii) G. duodenalis киста инфекция тобу (1,5 х 106 кисталар / чычкан гаваж менен, 3 сааттан кийин, 100 мкл / чычкан PBS 7 күн бою күн сайын intraperitoneally башкарылат);(iv) G. duodenalis кистасын бириктирилген инфекция тобу MCC950 ингибиторунун дарылоо тобу (1,5 × 106 киста / чычкан аркылуу 10 мг / кг дене салмагы MCC950 7 күн бою 3 саатта).Ар бир чычкандын дене салмагына күн сайын мониторинг жүргүзүлүп, бардык чычкандар 7-күнү эвтанизацияланган.Түшүм алынган он эки эли ичеги (узундугу 3 см) 1 мл PBS менен майда бөлүктөргө кесилген, кисталар 4 ° C PBS ичинде түнү жок кылынган жана G. duodenalis trophozoites.Жаңы он эки эли ичеги (узундугу 1 см) гематоксилин жана эозин (H&E) менен боёо үчүн бөлүнгөн.
Чычкандар эки топко бөлүнгөн: (i) MOCK башкаруу тобу жана (ii) MCC950 ингибиторун тобу.Ар бир топто беш дарылоо болгон (n = 7 / дарылоо тобу): (i) PBS менен дарылоо терс башкаруу тобу (PBS гана; 100 мкл/чычкан PBS, булчуңга (IM) инъекция (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) плазмиддик терс башкаруу тобу (100 мкг/чычкандын ДНКсы, булчуңга инъекция аркылуу (iii) G. duodenalis кистасынын инфекциясынын оң контролдук тобу (1,5 x 106 киста/чычкан, гаваж аркылуу) (iv) a pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 мкг/чычкан ДНКсы, булчуңга инъекция жолу менен) жана (v) pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 мкг/чычкан) плазмидасы менен дарыланган топ ДНК, 12 саат өткөндөн кийин, MCC950 ингибиторунун тобундагы чычкандар 7 күн бою MCC950 (10 мг/кг дене салмагына) күнүмдүк инъекциясын алышты, ал эми MOCK тобундагы чычкандар PBS менен бирдей көлөмдөгү дарылоону алышты. Кан үлгүлөрү алынган. чычкандардан чогултулган жана 4 °C түнгө калтырылган сары суунун үлгүлөрү IL-1β деңгээли үчүн ферментке байланышкан иммуносорбент анализи (ELISA) менен бөлүнүп алынган.
Отуз беш чычкан беш топко бөлүнгөн (n = 7 / топ).Group 1 PBS менен мамиле терс башкаруу тобу болгон: чычкандар PBS 100 мкл внутримышечно жана 3 күндөн кийин гаваж менен кабыл алынган.2-топ G. duodenalis кисталары менен ооруган оң контролдук топ болуп саналат: чычкандарга 100 мкл PBS сайылган, ал эми 3 күндөн кийин 1,5 х 106 киста/чычканга интрагастралдык түрдө сайылган.Үчүнчү топ – pcDNA3.1(+) менен плазмиддик иммунизация он эки эли ичегинин кистасынын инфекциясы үчүн контролдук топ менен айкалышта: чычкандар 100 мкг плазмиддик ДНК pcDNA3.1(+)(im) оозеки, 1.5×106 цист/чычкан 3 бир нече үчүн кабыл алды. күн.4 жана 5-топтор рекомбинантты pcDNA3.1(+)-alpha-2 лямбиддин плазмидасы же pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ляардин плазмиди G. duodenalis киста инфекциясы менен айкалышта болгон.Эксперименталдык топ: чычкандар 100 мкг pcDNA3 алышты.1(+)-гиардин плазмидинин ДНКсы (im), андан кийин 3 күндөн кийин 1,5 × 106 цист/чычкан гаваж аркылуу сайылган.G. duodenalis кистасын түтүк аркылуу киргизгенден кийин ар бир чычкандын дене салмагына көзөмөл жүргүзүлдү.Жаңы он эки эли ичеги паразиттик жүктү өлчөө жана HE боёо анализи үчүн чогултулду.
Гистологиялык өзгөрүүлөр мурда жарыяланган жол-жобосу боюнча талдоого алынган [30].Жаңы он эки эли ичеги кыртыш клеткасынын фиксатору менен бекитилип, парафинге салынып, 4 мкм бөлүкчөлөргө кесилип, H&E менен боёлуп, жарык микроскоптун астында анализденди.Жети көз карандысыз чычкандын жети кыртыш бөлүмдөрүндөгү өкүл патологиялык өзгөрүүлөрдү дарылоону билбеген патолог тарабынан бааланган жана 200x чоңойтууда тартылган.Мурда баяндалган методдор боюнча виллалардын узундугу жана крипттердин тереңдиги өлчөнгөн.
Натыйжалар in vitro жана in vivo үч нускада алынган.Графиктер GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, АКШ) аркылуу түзүлгөн.Эки топтун ортосундагы айырмачылыктар t-тест менен, ал эми ≥3 топтордун ортосундагы айырмачылыктар SPSS программасын (22.0 версиясы; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, АКШ) колдонуу менен дисперсиянын бир тараптуу анализи (ANOVA) менен талданды.Берилиштер дисперсиянын бир тектүүлүгү үчүн Левендин тести, андан кийин Бонферронинин пост-хок тести (B) менен анализденди.Маанилүүлүк P<0,05, P<0,01 жана P<0,001 (маанилүү эмес [ns]) катары көрсөтүлөт (P>0,05).
Киото энциклопедиясындагы гендердин жана геномдорунун (KEGG) GEV протеомикасына биздин мурунку анализибиз сезгенүү сигналынын жолдорун активдештирүү үчүн көптөгөн максаттар тартылышы мүмкүн экенин көрсөттү [13].Биз эки келечектүү максатты тандап алдык, альфа-2 жана альфа-7,3 гиардиндер, бул молекулаларды күчөтүп, аларды pcDNA3.1(+) эукариоттук экспрессия векторун куруу үчүн колдондук.Рекомбинантты pcDNA3.1(+)-alpha-2 жана alpha-7.3 Giardine экспрессия плазмидалары секвенирлөөдөн кийин чычкандын перитониалдык макрофагдарына трансфекцияланган жана сезгенүүнүн каспаза-1 p20 белги протеин (активдештирилген каспаза-1дин фрагменти) аныкталган. сезгенүүнү козгой турган негизги молекулаларды түшүндүрөт.Натыйжалар Alpha-2 жана Alpha-7.3 лямбдиндер GEV окшош p20 caspase-1 туюнтушу мүмкүн экенин көрсөттү.Тазаланбаган терс башкарууда (PBS гана) жана pcDNA3.1 (+) плазмиддик башкаруусунда каспаза-1 активдештирүүгө эч кандай таасири табылган жок (1-сүрөт).
pcDNA3.1(+)-alpha-2 жана alpha-7.3 лямберлер менен p20 каспас-1 активдештирүүнү өлчөө.Рекомбинантты эукариоттук экспрессия плазмидалары pcDNA3.1(+)-alpha-2 жана alpha-7.3 лямбдиндер (ар бир тилкеден жогору) чычкандын негизги перитонеалдык макрофагдарына трансфекцияланган жана маданияттын супернатанттары 24 сааттан кийин жыйналган.Western blotting кол каспас-1 p20 inflammasome протеининин экспрессия деңгээлин өлчөө үчүн колдонулган.PBS-жалаң дарылоо тобу (С тилкеси) жана pcDNA3.1 (+) монотерапия тобу (pcDNA3.1 тилкеси) терс контроль катары колдонулган, ал эми GEV дарылоо тобу оң башкаруу катары колдонулган.Рекомбинантты протеиндин экспрессиясы ар бир протеинде гистидин тегин аныктоо менен тастыкталды жана күтүлгөн протеин тилкелери альфа-2 ляардин (38,2 кДа) жана альфа-7,3 ляардин (37,2 кДа) болгон.GEV, Giardia duodenum клеткадан тышкаркы везикулалар, pcDNA3.1(+), EcoRV-линиаризацияланган вектор, SUP, супернатант
Alpha-2 Giardine жана Alpha-7.3 Giardine p20 caspase-1 экспрессиясын жана кабыл алуучу NLRP3 сезгенүү жооп, pcDNA3.1 (+) -alpha-2 Giardine жана pcDNA3.1 (+) -alpha жандандыруу бир ролду ойнойт же жокпу, аныктоо үчүн. -7.3 гиардин рекомбинантты плазмиддик ДНК менен чычкандын перитониалдык макрофагдарына трансфекцияланган жана NLRP3 негизги сезгенүү белокторунун экспрессиясынын, локализациясынын жана олигомеризациясынын деңгээли аныкталган.Бул экспериментте, GEV оң башкаруу тобу катары колдонулган, жана эч кандай дарылоо тобу (PBS гана) же pcDNA3.1 (+) transfection дарылоо тобу терс топ болгон.Натыйжалар GEV тобунда болгондой эле, лямбиддин pcDNA3.1(+)-alpha-2 жана лямбиддин pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 рекомбинантты плазмиддик ДНКсы NLRP3, pro-IL-1β жана прокаспаза-1 жана каспаза-1 активдештирүү (сүрөт 2а).Мындан тышкары, эки лямбдин тең олуттуу IL-1β секрециясын шарттаган (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; альфа-2 лямбдин: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.00 ).;alpha-7,3 лямбдин: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (2б-сүрөт).Көпчүлүк ASC протеиндер pcDNA3.1 (+) - альфа-2 же pcDNA3.1 (+) - альфа- айырмаланып, pcDNA3.1 (+) плазмида менен трансфекцияланган дарылоо тобунда же дарылоо тобунда мономердүү болгон. 7.3 лямбдин.ASC олигомеризациясы GEV оң башкаруу тобунун же тобунун рекомбинантты плазмиддик ДНКсында пайда болуп, олигомердик форманы көрсөткөн (Figure 2c).Бул алдын ала маалыматтар Alpha-2 Giardine жана Alpha-7,3 Giardine NLRP3 сезгенүүнү жандандыруу түрткү бере алат деп божомолдоого болот.ASC жана NLRP3 локализациясынын кийинки иммунофлуоресценттик изилдөөлөрү терс башкаруу тобунда ASC протеини цитоплазмага чачырап кеткендигин жана pcDNA3.1(+)-alpha-2 лямбдин же pcDNA3 менен стимулдоодо чекиттик сигнал катары пайда болгонун көрсөттү.1 (+) -alpha-7,3 лямбдин тобу же GEV оң башкаруу тобу (сүрөт 2d).Терс контролдоочу жана плазмида менен иштетилген pcDNA 3.1 топторунда NLRP3 белок сигналы аныкталган эмес, ал эми флуоресценттик сигнал pcDNA3.1 (+) - альфа-2 ляардин же pcDNA3.1 (+) - альфа-7.3 жооп катары чекит. аныкталды..лямбдин цитоплазмада же HEV стимулданганда кездешет (сүрөт 2e).Бул маалыматтар андан ары G. duodenalis giardin alpha-2 жана giardin alpha-7.3 чычкандын негизги перитонеалдык макрофагдарда NLRP3 inflammasome жандантуу экенин көрсөтүп турат.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin жана pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin чычкандын перитонеалдык макрофагдарында NLRP3 inflammasome жандантат.Рекомбинантты эукариоттук экспрессия плазмидаларын pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin жана pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardinди баштапкы мышыктын перитонеалдык макрофагдарына жана клеткаларына трансфекциялоо, же экспрессияны талдоо, олигомеризациялоо үчүн 24 сааттын ичинде супернатантты чогултуу , секреция.жана негизги сезгенүү протеиндердин локализациясы.PBS гана (C) тобу жана pcDNA3.1 (+) бир дарылоо тобу терс контролдоо катары колдонулган, ал эми GEV дарылоо тобу оң топ катары колдонулган.Негизги сезгенүү протеиндери NLRP3, анын ичинде NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 жана p20 caspase-1, Western blotting аркылуу аныкталган.b Супернатанттардагы IL-1β секрециясынын деңгээли ферментке байланышкан иммуносорбенттик анализдин (ELISA) жардамы менен аныкталган.Контролдук жана эксперименталдык топтордун ортосундагы айырмачылыктар SPSS программалык камсыздоонун 22.0 версиясын колдонуу менен дисперсиянын бир тараптуу анализи (ANOVA) аркылуу талданды.Жылдызчалар **P<0,01 жана ***P<0,001 топторунун ортосундагы олуттуу айырмачылыктарды көрсөтүп турат.с гранулдардагы ASC олигомеризация деңгээли DSS кайчылаш талдоо жолу менен аныкталган, ал эми клетка лизаттарындагы ASC деңгээли жүктөө контролу катары колдонулган.г Иммунофлуоресценцияны колдонуу менен ISC локализациясынын визуализациясы.e Immunofluorescence NLRP3 локализациясын көрүү үчүн колдонулган.ASC, апоптотикалык так сымал белок;ИЛ, интерлейкин;NLRP3, нуклеотиддерди байланыштырган олигомеризацияга окшош рецептор 3;ns, маанилүү эмес (P > 0,05)
G. duodenalis жана ал бөлүп чыгарган GEVs NLRP3 сезгенүүнү активдештирип, in vitro кабылдагычтын сезгенүү реакцияларын жөнгө салат.Ошентип, G. duodenalisтин патогендүүлүгүндө NLRP3 inflammasome ролу бүдөмүк бойдон калууда.Бул маселени иликтөө үчүн, биз G. duodenalis кистасы менен ооруган чычкандар менен G. duodenalis кистасы + MCC950 ингибитору менен ооруган чычкандардын ортосунда эксперимент иштеп чыктык жана G. duodenalis кистасы менен ооруган кезде NLRP3 inflammasome экспрессиясын салыштырдык.Эксперименттин толук схемасы 3а-сүрөттө көрсөтүлгөн.Ар кандай дарылоо топторундагы чычкандардын дене салмагынын өзгөрүшү кисталар менен жуккандан кийин 7 күн бою көзөмөлдөнүп, натыйжалар 3б-сүрөттө көрсөтүлгөн.Таза PBS менен дарыланган топко салыштырмалуу, натыйжалар (i) G. duodenalis кистасы менен ооруган чычкандардын дене салмагынын инфекциядан кийин 3 күндөн 7 күнгө чейин азайгандыгын көрсөттү;(ii) MCC950 ингибитору менен дарылоо чычкандардын дене салмагына олуттуу таасир тийгизген эмес..Жалгыз инфекция тобуна салыштырмалуу, MCC950 менен дарыланган он эки эли ичегинин инфекциясы тобунун BW деңгээли ар кандай даражаларга чейин төмөндөгөн (1-күн: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; 2-күн: ANOVA, F(3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001 3-күн: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 5-күн: A (3, 24)=0,6497, P=0,0645; 6-күн: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175; 7-күн: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Бул маалыматтар NLRP3 inflammasome он эки эли ичегинин инфекциясынын алгачкы стадияларында (2-4 күн) олуттуу салмак жоготуудан чычкандарды коргой турганын көрсөтүп турат.Андан кийин биз он эки эли ичегини жууган суюктуктан G. duodenalis trophozoites аныктоону максат кылдык жана натыйжалар 3c-сүрөттө көрсөтүлгөн.G. duodenalis киста инфекция тобу менен салыштырганда, он эки эли ичегидеги trophozoites саны NLRP3 inflammasome (t (12) = 2.902, P = 0.0133) бөгөт коюу кийин бир кыйла көбөйгөн.HE менен боёлгон он эки эли ичегинин ткандары бир гана PBS жана MCC950 менен дарыланган терс контролго салыштырганда көрсөттү: (i) G. duodenalis кистасынын инфекциясы он эки эли ичегинин вилласынын бузулушуна алып келди (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0488 ) жана крипт атрофиясы (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) G. duodenalis кисталары менен ооруган жана MCC950 ингибиторлору менен дарыланган чычкандардын он эки эли ичеги.он эки эли ичегинин villi бузулган жана өлгөн (ANOVA, F (3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) атрофиясы жана крипт бутактануу менен (ANOVA, F (3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (сүрөт. 3d- е) .Бул жыйынтыктар NLRP3 inflammasome G. duodenalis патогендүүлүгүн азайтуу ролду ойнойт деп ойлойм.
Giardia он эки эли ичеги инфекциясында NLRP3 inflammasome ролу.Чычкандар он экиденококк кисталары менен гавага алынган (iv) жана андан кийин MCC950 (ip) менен же ансыз дарыланган.PBS же MCC950 менен бирдиктүү дарылоо топтору башкаруу катары колдонулган.Эксперименталдык топ жана дарылоо режими.б Ар кандай дарылоо топторунун ар биринде чычкандардын дене салмагы 7 күн бою көзөмөлгө алынган.G. duodenalis инфекция тобу менен G. duodenalis + MCC950 инфекциясын дарылоо тобунун ортосундагы айырма SPSS программалык камсыздоонун 22.0 версиясын колдонуу менен t-тест аркылуу талданды.Жылдызчалар *P<0,05, **P<0,01 же ***P<0,001 боюнча олуттуу айырмачылыктарды көрсөтүп турат.в Паразиттик жүк он эки эли ичегини жууган суюктуктагы трофозоиттердин санын эсептөө менен аныкталган.G. duodenalis инфекция тобу менен G. duodenalis + MCC950 инфекциясын дарылоо тобунун ортосундагы айырма SPSS программалык камсыздоонун 22.0 версиясын колдонуу менен t-тест аркылуу талданды.Жылдызчалар *P <0,05 олуттуу айырмачылыктарды көрсөтүп турат.г Он эки эли ичегинин гистопатологиясынын гематоксилин жана эозин (H&E) менен боёо жыйынтыктары.Кызыл жебелер вилланын бузулгандыгын, жашыл жебелер крипттердин бузулушун көрсөтүп турат.Масштаб тилкеси: 100 μm.e, f Он эки эли ичегинин виллусунун бийиктигинин жана чычкандын криптинин бийиктигинин статистикалык анализи.Жылдызчалар *P<0,05 жана **P<0,01 боюнча олуттуу айырмачылыктарды көрсөтүп турат.Натыйжалар 7 көз карандысыз биологиялык эксперименттен алынган.BW, дене салмагы;ig, ашказанга жеткирүү жолу;ip, интраперитонеалдык жеткирүү жолу;ns, маанилүү эмес (P > 0,05);PBS, фосфаттык буфердик туз;WT, жапайы түрү
IL-1β секрециясы сезгенүүнү активдештирүүнүн белгиси болуп саналат.G. duodenalis Alpha-2 Giardine жана Alpha-7.3 Giardine in vivo NLRP3 кабыл алуучу inflammasome жандандыруу же жокпу, аныктоо үчүн, биз тазаланбаган WT чычкандар (жалган топ) жана NLRP3 inflammasome-бөгөт чычкандар (MCC950 тоскоол дарылоо тобу) колдонулат.Эксперименттин толук схемасы 4а-сүрөттө көрсөтүлгөн.Эксперименталдык топтор PBS менен мамиле кылган чычкандардан турган, G. duodenalis кистасын гаваж менен дарылоо, pcDNA3.1 инъекциясы жана булчуңга pcDNA3.1 (+) -альфа-2 гиардин же pcDNA3.1-alpha-7.3 гиардин.Рекомбинантты плазмидди булчуңга киргизгенден кийин 7-күнү сыворотка чогултулуп, ар бир топтогу IL-1β деңгээли аныкталды.4b-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, MOCK тобунда: (i) PBS тобуна салыштырмалуу, pcDNA3.1 дарылоо IL-1β секрециясына олуттуу таасир тийгизген эмес (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P = 0.9998), бирок, IL-β секрециясы G. duodenalis киста тобунда (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (II) pcDNA3.1-alpha-2 лямин жана pcDNA3 бир кыйла жогорулаган.1- Alpha-7.3 лямбдиндин булчуңга инъекциясы кандагы IL-1β деңгээлин кыйла жогорулатты (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P <0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 лямбдин pcDNA3.1-alpha-2 лямбдин булчуңга сайынуу тобунда IL -1β секрециясынын жогорку деңгээлин шарттады (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.033) .MCC950 дарылоо тобунун жана MOCK тобунун ар бир тобу менен салыштырганда: (i) PBS башкаруу тобунда IL-1β секреция деңгээли жана pcDNA3.1 контролдоо тобу MCC950 ингибиторун бөгөттөгөндөн кийин белгилүү бир деңгээлде азайган, бирок айырма болгон эмес. олуттуу (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) MCC950 бөгөттөөдөн кийин., IL-1β секрециясы G. duodenalis киста жуккан тобунда, pcDNA3.1-alpha-2 лямбдин тобунда жана pcDNA3.1-alpha-7.3 гиардин тобунда (G. duodenalis: ANOVA, F (9)) олуттуу кыскарган. , 58) = 3.540 , P = 0.0120 pcDNA3.1-alpha-2 лямбдин: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447 pcDNA3.1-alpha-7.3, FNO5; ) = 3,540, P = 0,0164).Бул жыйынтыктар Alpha-2 Giardine жана Alpha-7.3 Giardine in vivo NLRP3 inflammasome активдештирүүгө ортомчу экенин көрсөтүп турат.
pcDNA3.1(+)-лямдиндер in vivo NLRP3 хостунун inflammasome жандантат.Чычкандар рекомбинантты эукариоттук экспрессия плазмидасы pcDNA3.1(+)-альфа-2 ляардин же pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 ляардин менен иммунизацияланган (IM) жана андан кийин MCC950 (ip; MCC950 тобу) менен мамиле кылынган же андай эмес (думмикалык топ) ).PBS же pcDNA3.1 (+) плазмиддик дарылоо тобу терс башкаруу катары колдонулган, G. duodenalis кистасын дарылоо тобу оң башкаруу катары колдонулган.Эксперименталдык топ жана дарылоо режими.b Чычкандардагы IL-1βнын сывороттук деңгээли 7-күнү ELISA анализи менен өлчөнгөн.MOCK тобундагы топтордун ортосундагы айырмачылыктар бир тараптуу ANOVA колдонуу менен талданды, ал эми MOCK тобу менен MCC950 тобунун ортосундагы айырмачылыктар SPSS программалык версиясынын 22.0 t-тестинин жардамы менен талданды.Жылдызчалар MOCK тобунда дарылоо топторунун ортосундагы олуттуу айырмачылыктарды көрсөтүп турат, * P <0.05 жана *** P <0.001;доллар белгилери ($) P<0.05 боюнча MOCK тобунун жана MCC950 тобунун ар бир тобунун ортосундагы олуттуу айырмачылыктарды көрсөтүп турат.Жети көз карандысыз биологиялык эксперименттердин натыйжалары.i, булчуңга инъекция, ns, маанилүү эмес (P > 0,05)
G. duodenalis infectivity боюнча NLRP3 кабыл алуучу inflammasome менен Alpha-2 жана Alpha-7.3 Giardine-арачы жандандыруу таасирин иликтөө үчүн, биз WT C57BL / 6 чычкандар колдонулган жана Alpha-2 Giardine жана Alpha-7.3 Giardine сайылган.плазмидди булчуңга, G. duodenalis кистасынын ашказан түтүгү аркылуу 3 күндөн кийин киргизген, андан кийин чычкандарга 7 күн байкоо жүргүзүлгөн.Эксперименттин толук схемасы 5а-сүрөттө көрсөтүлгөн.Ар бир чычкандын дене салмагын күн сайын өлчөп, жаңы он эки эли ичегинин ткандарынын үлгүлөрү ашказан түтүгү аркылуу берилгенден кийин 7-күнү чогултулуп, трофозоиттердин саны өлчөнгөн жана гистопатологиялык өзгөрүүлөр байкалган.5b-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, тамактандыруу убактысынын көбөйүшү менен ар бир топтогу чычкандардын BW деңгээли акырындык менен көбөйдү.Чычкандардын МТ G. duodenalis кистасын ичке киргизгенден кийин 3-күнү азайып, акырындап көбөйө баштады.Alpha-2 giardine жана alpha7.3 giardine булчуңга сайынуу менен шартталган NLRP3 inflammasome активдештирүү чычкандардын салмагын жоготууну кыйла алсыраткан (1-күн: pcDNA3.1-alpha-2 лямдин, ANOVA, F (4, 30) = 1. = 0 .9754 1-күн: pcDNA3.1-alpha-7.3 лямбдин, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 2-күн: pcDNA3.1-alpha-2 лямбдин, ANOVA, F( 4, 30) = 0,3172, P = 0,9979 2-күн: pcDNA3.1-alpha-7.3 лямбдин, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409 3-күн: pcDNA3.1-alpha-2 giard, 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 3-күн: pcDNA3.1-alpha-7.3 лямбдин, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083 4-күн: pcDNA3.1-alpha, , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, 4-күн: pcDNA3.1-alpha-7.3 лямбдин, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P <0.0001, 5-күн: pcDNA3.1-alpha 2 лямбдин, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P <0,0001 5-күн: pcDNA3.1-alpha -7,3 лямбдин, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P <0,0001 6-күн: pc -DNA alpha-2 лямбдин, ANOVA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, 6-күн: pcDNA3.1-alpha-7.3 лямдин, ANOVA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;7-күн: pcDNA3.1-alpha-2 лямбдин, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 7-күн: pcDNA3.1-alpha-7.3 лямбдин, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, <0,0001).Он эки эли ичегиде паразиттик жүк бааланган (сүрөт 5c).Тазаланбаган позитивдүү контролго жана бош pcDNA3.1 вектору менен инъекцияланган топко салыштырмалуу, G. duodenalis trophozoites саны α-2 ляардин жана α-7,3 ляардин (pcDNA3.1-alpha) менен инъекцияланган топтордо кыйла азайган. -2 лямбдин: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 лямбдин: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P <0.0001).Мындан тышкары, лямбдин alfa-7.3 лямбдин альфа-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0081) караганда чычкандарда көбүрөөк коргоочу болгон.HE боёонун натыйжалары 1-сүрөттө көрсөтүлгөн.5d–f.Alpha-2 Giardine жана Alpha-7.3 Giardine менен сайылган чычкандарда G. duodenalis менен инъекцияланган чычкандарга жана бош pcDNA3 вектору .1 Zoom менен бирге G. duodenalis сайылган чычкандарга салыштырмалуу он эки эли ичеги кыртышынын жабыркашы азыраак болгон.(pcDNA3.1-alpha-2 лямбдин: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 же P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 лямин: ANOVA, F(3, 24) = 2.46 = 0,0028 же P = 0,0055) жана кыскартылган крипт атрофиясы (pcDNA3.1-alpha-2 лямин: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 же P = 0.0158; pcDNA3.1-alphaine: ANOVA- , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 же P = 0,0191).Бул жыйынтыктар, alpha-2 лямбдин жана alpha-7,3 лямардин in vivo NLRP3 inflammasome жандандыруу менен G. duodenalis жугуштуулугун азайтат деп ойлойм.
G. duodenalis инфекциясында pcDNA3.1(+)-гиардиндердин ролу.Чычкандар рекомбинантты эукариоттук экспрессия плазмиддери pcDNA3.1(+)-alpha-2 ляардин же pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ляардин менен иммунизацияланган (IM) жана андан кийин G. duodenalis кисталары (ig) менен сыналган.PBS тобу жана pcDNA3.1 (+) + он эки эли ичегинин кистасын дарылоо тобу терс контролдук топтор катары, ал эми он эки эли ичегинин кистасын дарылоо тобу оң башкаруу тобу катары колдонулган.Эксперименталдык топ жана дарылоо режими.б Ар кандай дарылоо топторунун ар биринде чычкандардын MT 7 күн пост-кыйынчылык боюнча мониторинг жүргүзүлгөн.Жылдызчалар G. duodenalis тобундагы топтор менен pcDNA3.1(+)-альфа-2 лямбдин тобунун ортосундагы олуттуу айырмачылыктарды көрсөтүп турат, *P <0.05, **P <0.01 жана ***P <0.001;доллар белгиси ($) G. duodenalis ар бир тобу менен pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 жардин тобунун, $$P<0.01 жана $$$P<0.001 ортосундагы олуттуу айырманы көрсөтөт.в Паразиттик жүк он эки эли ичегиден (узундугу 3 см) 1 мл он эки эли ичегини жуугандагы трофозоиттердин санын эсептөө жолу менен аныкталды жана он эки эли ичегидеги мителердин саны катары көрсөтүлдү.G. duodenalis инфекция тобу, pcDNA3.1(+)-alpha-2 лямбдин тобу жана pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 лямбдин тобунун ортосундагы айырмачылыктар SPSS программалык версиясынын 22.0 версиясын колдонуу менен бир тараптуу ANOVA тарабынан талданды.Жылдызчалар **P<0,01 жана ***P<0,001 боюнча олуттуу айырмачылыктарды көрсөтүп турат.г Он эки эли ичегидеги гистопатологиялык өзгөрүүлөр.Кызыл жебелер вилланын бузулгандыгын, жашыл жебелер крипттердин бузулушун көрсөтүп турат.Масштаб тилкеси: 100 μm.e, f Чычкандардын он эки эли ичегисинин бийиктигинин (e) жана криптинин бийиктигинин (f) статистикалык анализи.Сүрөт 1d топтордун ортосундагы айырмачылыктар SPSS программалык версия 22.0 колдонуу менен бир тараптуу ANOVA тарабынан талданды.Жылдызчалар *P<0,05 жана **P<0,01 боюнча олуттуу айырмачылыктарды көрсөтүп турат.Жети көз карандысыз биологиялык эксперименттердин натыйжалары.ns, маанилүү эмес (P > 0,05)
Лямблия он эки эли ичеги — адамдын жана башка сүт эмүүчүлөрдүн ичегидеги белгилүү мителери, лямблиозду козгойт.2004-жылы ал 6 жыл бою, өзгөчө социалдык-экономикалык абалы төмөн жамааттарда кеңири таралгандыктан, ДСУнун көңүл бурулбаган оорулар демилгесине киргизилген [32].Тубаса иммундук система G. duodenalis инфекциясына каршы иммундук реакцияда маанилүү роль ойнойт.Чычкандардын макрофагдары G. duodenalisти клеткадан тышкаркы тузактарды чыгаруу менен жутуп, өлтүрөрү кабарланган [33].Биздин мурунку изилдөөлөр көрсөткөндөй, G. duodenalis, клеткадан тышкаркы мите эмес, p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 жана NLRP3 сезгенүү сигналынын жолдорун чычкандын макрофагдарында активдештирип, кабыл алуучу сезгенүү жоопторун жөнгө салат жана GEV бул процессти күчөтүшү мүмкүн.13], 24].Бирок, GEVдеги NLRP3 inflammasome менен жөнгө салынуучу сезгенүүгө катышкан так PAMPs жана лямблиоздогу NLRP3 inflammasome ролу дагы эле тактала элек.Бул эки суроону ачыктоо үчүн биз бул изилдөөнү жүргүздүк.
NLRP3 inflammasome иммундук клеткалардын цитоплазмасында жайгашкан жана заара кислотасынын кристаллдары, токсиндер, бактериялар, вирустар жана мителер сыяктуу ар кандай бөлүкчөлөр тарабынан активдештирилиши мүмкүн.Бактериялык изилдөөлөрдө токсиндер сезгенүү сенсорлорун активдештирип, сезгенүүгө жана клетканын өлүмүнө алып келген негизги ПАМПлар катары аныкталган [34].Кээ бир структуралык жактан ар түрдүү токсиндер, мисалы, алтын стафилококктун гемолизини [35] жана ичеги таякчасы [36], энтеротоксинден (NHE) [37] гемолизин BL (HBL) [37] NLRP3 сезгенүүсүн активдештирет.Вирустук изилдөөлөр көрсөткөндөй, SARS-COV-2 конверт (E) протеин [38] жана Zika вирус NS5 протеин [39] сыяктуу вируленттүү протеиндер NLRP3 кабылдагычы тарабынан таанылган маанилүү PAMPs болуп саналат.Паразиттерди изилдөөдө көптөгөн мителердин Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] жана Лейшмания [42] сыяктуу хозяиндин сезгенүүсүнүн активдешүүсү менен байланышы бар экендиги билдирилди.Toxoplasma gondii вируленттүүлүгү менен байланышкан тыгыз гранул белоктору GRA35, GRA42 жана GRA43 Льюис келемиш макрофагдарында пироптозду индукциялоо үчүн талап кылынат [43].Мындан тышкары, кээ бир лейшмания изилдөөлөрү NLRP3 inflammasome катышкан жеке молекулаларга багытталган, мисалы, мите мембрана липофосфогликан [44] же цинк металлопротеаза [45].Анексинге окшош альфа-гиардин гендердин үй-бүлөсүнүн ичинен альфа-1 лярдин чычкан моделинде G. duodenalisке каршы коргоону камсыз кылуучу потенциалдуу вакцинага талапкер экени көрсөтүлгөн [18].Изилдөөбүздө биз G. duodenalis вируленттүүлүгүнүн факторлору альфа-2 жана альфа-7,3 лямблияга гана таандык, бирок салыштырмалуу азыраак кабарланган лямблияларды тандап алдык.Бул эки максаттуу гендер сезгенүүнү активдештирүү анализи үчүн pcDNA3.1(+) эукариоттук экспрессия системасынын векторуна клондолгон.
Биздин чычкан моделибизде, кесилген каспас фрагменттери сезгенүүнү активдештирүү маркерлери катары кызмат кылат.Стимулданганда, NLRP3 ASC менен өз ара аракеттенет, прокаспазаларды тартат жана pro-IL-1β жана pro-IL-18ди жетилген IL-1β жана IL-18ге бөлгөн активдүү каспастарды жаратат, тиешелүүлүгүнө жараша -18.Сезгенүү каспаздары (каспазалар-1, -4, -5 жана -11) тубаса коргонуу үчүн маанилүү болгон цистеин протеазаларынын сакталган үй-бүлөсү жана сезгенүүгө жана программаланган клетка өлүмүнө катышат [46].Каспаза-1 канондук inflammasomes [47] тарабынан активдештирилет, ал эми каспазалар-4, -5 жана -11 атиптик inflammasomes [48] пайда болгон учурда бөлүнөт.Бул изилдөөдө биз чычкандын перитонеалдык макрофагдарын үлгү катары колдондук жана G. duodenalis инфекциясын изилдөөдө NLRP3 сезгенүүнү активдештирүү маркери катары p20 caspase-1 cleaved caspase-1ди изилдедик.Натыйжалар көптөгөн альфа-гиардиндер сезгенүүнүн типтүү активдешүүсү үчүн жооптуу экенин көрсөттү, бул бактериялар менен вирустарга катышкан негизги вируленттик молекулалардын ачылышына шайкеш келет.Бирок, биздин изилдөөбүз алдын ала экран болуп саналат жана классикалык эмес inflammasomes активдештире турган башка молекулалар бар, анткени биздин мурунку изилдөөбүздө G. duodenalis инфекциясында классикалык жана классикалык эмес inflammasomes табылган [13].Түзүлгөн p20 caspase-1 NLRP3 inflammasome менен байланышы бар-жогун аныктоо үчүн, биз альфа-2 жана альфа-7.3 лямардиндерди чычкандын перитонеалдык макрофагдарына трансфекциялап, негизги молекула протеининин экспрессия деңгээлин жана ASC олигомеризациясынын деңгээлин аныктап, эки α-лямдиндин тең активдештирилгендигин тастыктадык. сезгенүү NLRP3.Биздин натыйжалар G. muris же E. coli EPEC штаммдары менен Caco-2 клеткаларын стимулдаштыруу NLRP3, ASC жана каспаза-1дин флуоресценция интенсивдүүлүгүн жогорулата алат деп билдирген Manko-Prykhoda жана башкалардан бир аз айырмаланат. олуттуу болбосо да, G. muris жана E. coli костимуляциясы үч белоктун деңгээлин кантип жогорулаткан [49].Бул карама-каршылык Giardia түрлөрүн, клетка линияларын жана негизги клеткаларды тандоодогу айырмачылыктарга байланыштуу болушу мүмкүн.Биз ошондой эле G. duodenalisке көбүрөөк кабылган 5 жумалык ургаачы WT C57BL/6 чычкандарында MCC950 аркылуу in vivo анализдерин жүргүздүк.MCC950 күчтүү жана тандалма чакан молекула NLRP3 ингибитору болуп саналат, ал наномолярдык концентрацияларда канондук жана канондук эмес NLRP3 активдештирүүсүнө бөгөт коёт.MCC950 NLRP3 активдештирүүсүнө бөгөт коёт, бирок AIM2, NLRC4 жана NLRP1 сезгенүү жолдорунун же TLR сигналдык жолдорунун активдештирилишине таасир этпейт [27].MCC950 NLRP3 активдештирүүсүнө бөгөт коёт, бирок NLRP3 инициациясын, K+ агып чыгуусун, Ca2+ агымын же NLRP3 менен ASC ортосундагы өз ара аракеттенүүнү бөгөттөбөйт;анын ордуна, ал ASC oligomerization бөгөт коюу менен NLRP3 inflammasome жандандыруу тоскоол болот [27].Ошондуктан, биз Giardine сайынуу кийин NLRP3 inflammasome ролун аныктоо үчүн in vivo изилдөө MCC950 колдонулат.Активдештирилген каспаза-1 p10 сезгенүүгө каршы цитокиндерди pro-IL-1β жана pro-IL-18ди жетилген IL-1β жана IL-18ге бөлөт [50].Бул изилдөөдө, MCC950 менен же жок лямбдин менен дарыланган чычкандардагы IL-1β деңгээли NLRP3 inflammasome иштетилгендигинин көрсөткүчү катары колдонулган.Күтүлгөндөй эле, MCC950 дарылоо олуттуу IL-1β кан сары суусун кыскарган.Бул маалыматтар G. duodenalis giardin alfa-2 жана giardin alfa-7.3 NLRP3 чычкан inflammasome жандандырууга жөндөмдүү экенин ачык-айкын көрсөтүп турат.
Акыркы он жылдыкта топтолгон олуттуу маалыматтар IL-17A G. muris каршы иммунитеттин башкы жөнгө салуучусу, IL-17RA сигналын индукциялоочу, антимикробдук пептиддерди өндүрүү жана комплементтин активдешүүсүн жөнгө салуучу [51] экенин көрсөттү.Бирок, лямблия инфекциясы жаш кишилерде көбүрөөк кездешет жана жаш чычкандардагы лямблия инфекциясы IL-17A реакциясын активдештирип, анын коргоочу эффектин [52] көрсөтпөйт, бул изилдөөчүлөрдү башка иммуномодулятордук лямблияны издөөгө түрттү.гельминттердин жугуштуу механизмдери.Жакында жүргүзүлгөн изилдөөнүн авторлору G. muris NLRP3 inflammasome E. coli EPEC тарабынан активдештире аларын билдиришкен, ал антимикробдук пептиддердин өндүрүшүн өбөлгө түзөт жана ичеги-карын трактындагы трофозоиттердин санын азайтат, ошону менен жоон ичегинин оордугун азайтат. таякчалардан пайда болгон оорулар [49].NLRP3 inflammasome ар кандай оорулардын өнүгүшүнө катышат.Изилдөөлөр көрсөткөндөй, Pseudomonas aeruginosa клетканын өлүшүнө жол бербөө үчүн макрофагдарда аутофагияны козгойт жана бул процесс NLRP3 inflammasome [53] активдешүүсүнөн көз каранды.N. caninum үчүн, NLRP3 inflammasome реактивдүү кычкылтек түрлөрү аркылуу активдештирүү анын хостто репликациясын чектеп, аны потенциалдуу терапиялык максатка айлантат [9].Paracoccidioides brasiliensis чычкандын жилик чучугунан алынган дендриттик клеткаларда NLRP3 inflammasome активдештирүүсүн шарттайт, натыйжада сезгенүү цитокин IL-1β бөлүнүп чыгат, ал кабыл алуучу коргонууда маанилүү ролду ойнойт [10].Лейшманиянын бир нече түрлөрү, анын ичинде L. amazonensis, L. major, L. braziliensis жана L. infantum chagasi макрофагдарда NLRP3 жана ASC-каранды каспас-1ди, ошондой эле Leishmania инфекциясын активдештирет.NLRP3/ASC/caspase-1 гени жетишсиз чычкандарда мителердин репликациясы жакшырат [11].Замбони жана башкалар.Лейшмания инфекциясы клетка ичиндеги мите репликациясын чектеген макрофагдарда NLRP3 inflammasome активдештирүүсүн шарттайт.Ошентип, Leishmania качуу стратегиясы катары NLRP3 активдештирүүгө тоскоол болушу мүмкүн.In vivo изилдөөлөрүндө NLRP3 inflammasome лейшманияны жок кылууга салым кошкон, бирок ткандарга таасир эткен эмес [54].Тескерисинче, гельминтозду изилдөөдө NLRP3 inflammasome активдештирүү ичеги-карын гельминтозуна каршы ээсинин коргоочу иммунитетин басат [12].Шигелла дүйнө жүзү боюнча диареяны пайда кылган негизги бактериялардын бири.Бул бактериялар IL-1β өндүрүшүн P2X7 рецептордук К+ агып чыгуусу, реактивдүү кычкылтек түрлөрү, лизосомалык кычкылдануу жана митохондриялык зыян аркылуу жаратышы мүмкүн.NLRP3 сезгенүү фагоцитозду жана макрофагдардын шигеллага каршы бактерициддик активдүүлүгүн терс жөнгө салат [55].Plasmodium изилдөөлөр көрсөткөндөй, AIM2, NLRP3 же каспаза-1 жетишсиздиги бар чычкандар плазмодий менен ооруган 1-типтеги интерферондун жогорку деңгээлин өндүрөт жана Plasmodium инфекциясына туруктуураак болот [56].Бирок, чычкандарда NLRP3 сезгенүүсүнүн патогендик активдештирүүсүнө Alpha-2 Giardine жана Alpha-7.3 Giardine ролу түшүнүксүз.
Бул изилдөөдө, MCC950 тарабынан NLRP3 inflammasome бөгөт коюу BW кыскарган жана чычкандардын ичеги жууган суюктуктун trophozoites санын көбөйтүп, он эки эли ичеги кыртышында кыйла оор патологиялык өзгөрүүлөргө алып келди.Alpha-2 giardine жана alpha-7.3 giardine кабыл алуучу чычкан NLRP3 inflammasome активдештирип, чычкандын дене салмагын көбөйтүү, ичеги жуугуч суюктукта trophozoites санын азайтат жана патологиялык он эки эли ичегинин жабыркоолорун жеңилдетет.Бул жыйынтыктар G. duodenalis чычкандардын G. duodenalis патогендүүлүгүн азайтуу, alpha-2 giardine жана alpha-7,3 лямбара аркылуу NLRP3 кабыл алуучу inflammasome жандандыруу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Жалпысынан, биздин натыйжалар Alpha-2 жана Alpha-7.3 лямбдиндер NLRP3 кабыл алуучу inflammasome активдештирүү жана G. duodenalis чычкандардын жугуштуулугун төмөндөтөт деп көрсөтөт.Ошондуктан, бул молекулалар лямблиоздун алдын алуу үчүн келечектүү максаттар болуп саналат.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Лямблиоз: сереп.Жакында эле Пэт Inflamm дарыга аллергиясы бар экени аныкталган.2019;13:134–43.
Эскобедо AA, Tsimerman S. Giardiasis: фармакотерапияны карап чыгуу.Фармацевттин эксперттик корутундусу.2007;8: 1885–902.
Тянь Хуафэн, Чен Бин, Вэн Цзяньфэн.Лямблиоз, дарыга туруктуулук жана жаңы максаттарды табуу.Disord дары максаттарын жугат.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, ж.б. NLRP3 inflammasome жана сезгенүү оорулары.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Чен GY, Núñez G. ичеги сезгенүүсү жана рак менен inflammasome ролу.Гастроэнтерология.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Иммундук толеранттуулуктун жана ичеги сезгенүүсүнүн кесилишинде канондук жана атиптик NLRP3 inflammasome активдештирүү.алдын ала иммундук.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.ROS ортомчу NLRP3 inflammasome жандандыруу N. caninum жугуштуу жооп катышат.Мите вектор.2020;13:449.