Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат.Сиз колдонуп жаткан серепчинин версиясы чектелген CSS колдоосуна ээ.Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү).Ал ортодо, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Өпкөнүн муковисцидозун дарылоо үчүн ген векторлору өткөргүч аба жолдоруна багытталууга тийиш, анткени өпкөнүн перифериялык трансдукциясынын терапиялык таасири жок.Вирустун трансдукциясынын эффективдүүлүгү ташуучунун жашоо убактысына түздөн-түз байланыштуу.Бирок, ген ташыгычтар сыяктуу жеткирүүчү суюктуктар дем алуу учурунда альвеолаларга табигый түрдө тарайт жана ар кандай формадагы терапиялык бөлүкчөлөр мукоцилиардык транспорт аркылуу тез алынып салынат.Дем алуу жолдорунда ген алып жүрүүчүлөрдүн жашоо убактысын узартуу маанилүү, бирок ага жетишүү кыйын.Дем алуу жолдорунун бетине багыттала турган алып жүрүүчү-конъюгацияланган магниттик бөлүкчөлөр аймактык максаттуулугун жакшыртышы мүмкүн.In vivo сүрөттөөдөгү көйгөйлөрдөн улам, колдонулган магнит талаасынын катышуусунда аба жолунун бетиндеги мындай кичинекей магниттик бөлүкчөлөрдүн жүрүм-туруму начар түшүнүлөт.Бул изилдөөнүн максаты in vivo жалгыз жана жапырт бөлүкчөлөрдүн жүрүм-турумунун динамикасын жана моделдерин изилдөө үчүн анестезияланган келемиштердин трахеясында магниттик бөлүкчөлөрдүн бир катар кыймылын in vivo визуализациялоо үчүн синхротрондук сүрөттү колдонуу болгон.Андан кийин биз магнит талаасынын катышуусунда lentiviral магниттик бөлүкчөлөрдү жеткирүү келемиш трахеясында трансдукциянын натыйжалуулугун жогорулатабы же жокпу бааладык.Синхротрон рентгендик сүрөтү in vitro жана in vivo стационардык жана кыймылдуу магнит талаасында магниттик бөлүкчөлөрдүн жүрүм-турумун көрсөтөт.Бөлүкчөлөрдү магниттердин жардамы менен тирүү аба жолдорунун бети боюнча оңой сүйрөө мүмкүн эмес, бирок ташуу учурунда кендер магнит талаасы эң күчтүү болгон көрүү талаасында топтолот.Лентивирустук магниттик бөлүкчөлөр магнит талаасынын катышуусунда жеткирилгенде трансдукциянын эффективдүүлүгү да алты эсеге жогорулаган.Чогуу алганда, бул натыйжалар lentiviral магниттик бөлүкчөлөр жана магниттик талаалар ген векторунун максаттуулугун жана өткөргүч аба жолдорундагы трансдукция деңгээлин жакшыртуу үчүн баалуу ыкмалар болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Муковистикалык фиброз (CF) CF трансмембраналык өткөргүчтүк жөнгө салуучу (CFTR) деп аталган бир гендеги вариациялардан улам пайда болот.CFTR белок денедеги көптөгөн эпителий клеткаларында бар ион каналы, анын ичинде аба жолдору, цистикалык фиброздун патогенезиндеги негизги сайт.CFTR кемчиликтери анормалдуу суу ташуу, аба бетинин суусуздануу жана аба бетиндеги суюктук катмарынын (ASL) тереңдиктин төмөндөшүнө алып келет.Ошондой эле мукоцилиардык транспорттун (MCT) дем алуу жолдорун дем алган бөлүкчөлөрдөн жана козгогучтардан тазалоо мүмкүнчүлүгүн начарлатат.Биздин максат - CFTR генинин туура көчүрмөсүн жеткирүү жана ASL, MCT жана өпкөнүн саламаттыгын жакшыртуу үчүн lentiviral (LV) ген терапиясын иштеп чыгуу жана бул параметрлерди in vivo1 өлчөй алган жаңы технологияларды иштеп чыгууну улантуу.
LV векторлору муковисцидоз ген терапиясы үчүн алдыңкы талапкерлердин бири болуп саналат, анткени алар терапиялык генди аба жолдорунун базалдык клеткаларына (аба жолунун сөңгөк клеткаларына) биротоло интеграциялай алышат.Бул өтө маанилүү, анткени алар муковик фиброз менен байланышкан функционалдуу ген-түзөтүлгөн аба жолдорунун беттик клеткаларына дифференциациялоо аркылуу нормалдуу гидратацияны жана былжырды тазалоону калыбына келтирип, өмүр бою пайда алып келет.LV векторлору өткөргүч дем алуу жолдоруна каршы багытталышы керек, анткени өпкөнүн CF тартылуусу ушул жерден башталат.Вектордун өпкөгө тереңирээк жеткирилиши альвеолярдык трансдукцияга алып келиши мүмкүн, бирок бул цистикалык фиброздо эч кандай терапевтик эффект бербейт.Бирок, ген ташыгычтар сыяктуу суюктуктар төрөттөн кийин дем алганда табигый түрдө альвеолаларга көчүп кетет3,4 жана терапиялык бөлүкчөлөр MCTs аркылуу ооз көңдөйүнө тез чыгарылат.LV трансдукциясынын эффективдүүлүгү түздөн-түз вектордун уюлдук сиңирүүгө мүмкүндүк берүү үчүн максаттуу клеткаларга жакын калган убакыттын узактыгына байланыштуу - "жашоо убактысы" 5, ал жөнөкөй аймактык аба агымы, ошондой эле былжыр жана MCT бөлүкчөлөрүн макулдашылган кабыл алуу менен кыскартылат.Муковисцидоз үчүн, аба жолдорунда LV жашаган убакытты узартуу жөндөмдүүлүгү бул чөйрөдө трансдукциянын жогорку деңгээлине жетишүү үчүн маанилүү, бирок буга чейин кыйын болуп келген.
Бул тоскоолдукту жеңүү үчүн LV магниттик бөлүкчөлөр (МП) бири-бирин толуктаган эки жол менен жардам берерин сунуштайбыз.Биринчиден, алар максаттуу жакшыртуу жана ген ташуучу бөлүкчөлөр аба жолунун туура аймагында болууга жардам берүү үчүн аба бетине магнит менен жетектелиши мүмкүн;жана ASL) клетка катмарына жылат 6. Депутаттар антителолорго, химиотерапиялык препараттарга же клетка мембраналарына жабышкан же алардын клетка бетинин рецепторлоруна туташып, шишик жерлеринде чогулган башка майда молекулалар менен байланышып, дары-дармектерди жеткирүүчү каражат катары кеңири колдонулат. статикалык электр болушу.Рак терапиясы үчүн магниттик талаалар 7. Башка "гипертермикалык" ыкмалар термелүү магнит талаасынын таасири астында МПны жылытуу аркылуу шишик клеткаларын өлтүрүүгө багытталган.Магниттик трансфекциянын принциби, анда магнит талаасы ДНКнын клеткаларга өтүшүн күчөтүү үчүн трансфекциялык агент катары колдонулат, адатта in vitro режиминде трансдукциялоо кыйын болгон клетка линиялары үчүн вирустук эмес жана вирустук ген векторлорунун спектрин колдонуу менен колдонулат. ..Статикалык магнит талаасынын катышуусунда адамдын бронх эпителийинин клетка линиясына LV MP in vitro жеткирилиши менен LV магнитотрансфекциясынын эффективдүүлүгү аныкталды, бул LV векторуна салыштырмалуу трансдукциянын эффективдүүлүгүн 186 эсеге жогорулатты.LV MT ошондой эле цистикалык фиброздун in vitro моделине колдонулду, мында магниттик трансфекция муковисцидоз какырыгынын катышуусунда аба-суюктук интерфейсинин маданияттарында LV трансдукциясын 20 эсеге көбөйттү10.Бирок, in vivo орган magnetotransfection салыштырмалуу аз көңүл бурган жана бир нече жаныбарлардын изилдөөлөрүндө гана бааланган 11,12,13,14,15, айрыкча өпкөдө16,17.Бирок, муковисцидоздо өпкө терапиясында магниттик трансфекциянын мүмкүнчүлүктөрү айкын.Тан жана башкалар.(2020) "магниттик нанобөлүкчөлөрдү өпкө аркылуу натыйжалуу жеткирүү боюнча валидациялык изилдөө муковисцидоз менен ооруган бейтаптарда клиникалык натыйжаларды жакшыртуу үчүн келечектеги CFTR ингаляциялык стратегияларына жол ачат" деп билдирди.
Колдонулган магнит талаасынын катышуусунда дем алуу жолдорунун бетиндеги майда магниттик бөлүкчөлөрдүн кыймыл-аракетин элестетүү жана изилдөө кыйын, ошондуктан алар начар түшүнүлөт.Башка изилдөөлөрдө биз газ каналынын бетинин гидратациясын түздөн-түз өлчөө үчүн ASL18 тереңдигиндеги жана MCT19 жүрүм-турумундагы мүнөттүк in vivo өзгөрүүлөрүн инвазивдүү эмес сүрөттөө жана сандык аныктоо үчүн Синхротрондун жайылышына негизделген фазалык контрасттуу рентгендик сүрөттөө (PB-PCXI) ыкмасын иштеп чыктык. жана дарылоонун алгачкы көрсөткүчү катары колдонулат.Мындан тышкары, биздин MCT баллдык методубуз PB-PCXI21 менен көрүнгөн MCT маркерлери катары глиноземден же жогорку сынуу индексинен турган 10-35 мкм диаметрдеги бөлүкчөлөрдү колдонот.Эки ыкма тең бөлүкчөлөрдүн бир катар түрлөрүн, анын ичинде депутаттарды сүрөттөө үчүн ылайыктуу.
Улам жогорку мейкиндик жана убактылуу токтом, биздин PB-PCXI негизделген ASL жана MCT анализдер жакшы түшүнүүгө жана MP ген жеткирүү ыкмаларын оптималдаштырууга жардам берүү үчүн Vivo жалгыз жана жапырт бөлүкчөлөрдүн динамикасын жана жүрүм-турум үлгүлөрүн изилдөө үчүн ылайыктуу болуп саналат.Бул жерде биз колдонгон ыкма SPring-8 BL20B2 нур сызыгын колдонгон изилдөөлөрүбүзгө негизделген, анда биз байкалган гендердин гетерогендүү экспрессия үлгүлөрүн түшүндүрүүгө жардам берүү үчүн чычкандардын мурун жана өпкө аба жолдоруна жасалма вектордун дозасын жеткирүүдөн кийин суюктуктун кыймылын визуализациялаганбыз. биздин генибизде.3.4 алып жүрүүчү дозасы менен жаныбарларды изилдөө.
Бул изилдөөнүн максаты PB-PCXI синхротронду тирүү келемиштердин трахеясында бир катар депутаттардын in vivo кыймылдарын көрүү үчүн колдонуу болгон.Бул PB-PCXI сүрөттөө изилдөөлөрү MP сериясын, магнит талаасынын күчүн жана MP кыймылына алардын таасирин аныктоо үчүн жайгашкан жерин текшерүү үчүн иштелип чыккан.Биз тышкы магнит талаасы жеткирилген MF калууга же максаттуу аймакка жылышына жардам берет деп ойлогонбуз.Бул изилдөөлөр, ошондой эле чөккөндөн кийин трахеяда калган бөлүкчөлөрдүн санын максималдуу көбөйтүүчү магнит конфигурацияларын аныктоого мүмкүндүк берди.Изилдөөлөрдүн экинчи сериясында биз LV-МПны келемиштердин аба жолдоруна in vivo жеткирүүнүн натыйжасында келип чыккан трансдукция үлгүсүн көрсөтүү үчүн бул оптималдуу конфигурацияны колдонууну максат кылдык, бул аба жолдорун максаттуу контекстте LV-MPs жеткирүү натыйжа берет деген божомол менен. LV өткөрүүнүн натыйжалуулугун жогорулатууда..
Бардык жаныбарларды изилдөө Аделаида университети (M-2019-060 жана M-2020-022) жана SPring-8 Synchrotron Animal этика комитети тарабынан бекитилген протоколдорго ылайык өткөрүлдү.Эксперимент ARRIVE сунуштарына ылайык жүргүзүлдү.
Бардык рентген сүрөттөр Жапониядагы SPring-8 синхротрондо BL20XU нур сызыгында, мурда сүрөттөлгөндөй орнотууну колдонуу менен алынган21,22.Кыскача айтканда, эксперименталдык куту синхротрон сактоо шакегинен 245 м алыстыкта ​​жайгашкан.Үлгүдөн детекторго чейинки аралык бөлүкчөлөрдү сүрөттөө изилдөөлөрү үчүн 0,6 м жана фазалык контраст эффекттерин түзүү үчүн in vivo сүрөттөө изилдөөлөрү үчүн 0,3 м колдонулат.энергиясы 25 кеВ болгон монохроматтык нур колдонулган.Сүрөттөр sCMOS детекторуна кошулган жогорку резолюциядагы рентген-трансдуктордун (SPring-8 BM3) жардамы менен алынган.Өзгертүүчү рентген нурларын калыңдыгы 10 мкм сцинтиллятордун (Gd3Al2Ga3O12) жардамы менен көрүнүүчү жарыкка айлантат, ал андан кийин ×10 (NA 0,3) микроскоптун объективи аркылуу sCMOS сенсоруна багытталат.sCMOS детектору массив өлчөмү 2048 × 2048 пиксел жана чийки пиксел өлчөмү 6,5 × 6,5 мкм болгон Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Япония) болгон.Бул жөндөө 0,51 мкм эффективдүү изотроптук пиксел өлчөмүн жана болжол менен 1,1 мм × 1,1 мм көрүү талаасын берет.100 мс экспозициянын узактыгы дем алуудан келип чыккан кыймыл артефакттарын азайтуу менен аба жолдорунун ичиндеги жана сыртындагы магниттик бөлүкчөлөрдүн сигнал-ызы-чуу катышын максималдаштыруу үчүн тандалган.In vivo изилдөөлөр үчүн, экспозициянын ортосундагы рентген нурун бөгөттөө аркылуу нурлануунун дозасын чектөө үчүн рентген жолуна тез рентген жапкыч орнотулган.
LV медиасы эч кандай SPring-8 PB-PCXI сүрөттөө изилдөөлөрүндө колдонулган эмес, анткени BL20XU сүрөттөө камерасы Биологиялык коопсуздуктун 2-деңгээли менен тастыкталган эмес.Анын ордуна, биз эки коммерциялык сатуучудан бир катар өлчөмдөрдү, материалдарды, темирдин концентрациясын жана колдонууну камтыган бир катар жакшы мүнөздөлгөн депутаттарды тандап алдык - адегенде магниттик талаалар айнек капиллярлардагы депутаттардын кыймылына кандай таасир тийгизерин түшүнүү үчүн, андан кийин тирүү аба жолдору.бети.МПнын өлчөмү 0,25тен 18 мкмге чейин өзгөрөт жана ар кандай материалдардан жасалган (1-таблицаны караңыз), бирок ар бир үлгүнүн курамы, анын ичинде МПдагы магниттик бөлүкчөлөрдүн өлчөмү белгисиз.Биздин кеңири MCT изилдөөлөрүбүздүн негизинде 19, 20, 21, 23, 24, биз MP кыймылынын жакшыртылган көрүнүшүн көрүү үчүн, мисалы, ырааттуу алкактарды кемитүү аркылуу трахеянын аба жолдорунун бетинде 5 мкмге чейин төмөн депутаттарды көрүүгө болот деп күтөбүз.0,25 μm бир МП сүрөт тартуу аппаратынын чечүүчүлүгүнөн кичине, бирок PB-PCXI алардын көлөмдүк контрастын жана жайгаштырылгандан кийин жайгаштырылган беттик суюктуктун кыймылын аныктайт деп күтүлүүдө.
Таблицадагы ар бир депутат үчүн үлгүлөр.1 ички диаметри 0,63 мм болгон 20 мкл айнек капиллярларда (Drummond Microcaps, PA, АКШ) даярдалган.Корпускулярдык бөлүкчөлөр сууда, ал эми CombiMag бөлүкчөлөрү өндүрүүчүнүн жеке суюктугунда бар.Ар бир түтүк жарымы суюктук менен толтурулган (болжол менен 11 мкл) жана үлгү кармоочуга коюлган (1-сүрөттү караңыз).Айнек капиллярлар, тиешелүүлүгүнө жараша, сүрөт камерасында сахнага туурасынан жайгаштырылган жана суюктуктун четине жайгаштырылган.Сейрек кездешүүчү жер, неодим, темир жана бордон (NdFeB) (N35, кат. № LM1652, Jaycar Electronics, Австралия) жасалган диаметри 19 мм (узундугу 28 мм) никель кабыкчасы магнити 1,17 Т реманенси менен жабдылган. жетүү үчүн өзүнчө өткөрүп берүү таблицасы Көрсөтүү учурунда позицияңызды алыстан өзгөртүңүз.Рентген сүрөтү магнит үлгүдөн болжол менен 30 мм жогору жайгашканда башталат жана сүрөттөр секундасына 4 кадр менен алынат.Сүрөткө тартуу учурунда магнит айнек капиллярдык түтүккө жакындатылган (болжол менен 1 мм аралыкта), андан кийин талаанын күчүн жана абалынын таасирин баалоо үчүн түтүк боюнча жылдырылды.
xy үлгүсүн которуу стадиясында айнек капиллярлардагы МП үлгүлөрүн камтыган in vitro сүрөт орнотуу.Рентген нурунун жолу кызыл чекит сызык менен белгиленген.
Депутаттардын in vitro көрүнүшү белгиленгенден кийин, алардын бир бөлүгү жапайы түрдөгү ургаачы Wistar альбинос келемиштерде (~12 жумалык, ~200 г) in vivo сыналган.Медетомидин 0,24 мг/кг (Domitor®, Zenoaq, Япония), мидазолам 3,2 мг/кг (Dormicum®, Astellas Pharma, Япония) жана буторфанол 4 мг/кг (Vetorphale®, Meiji Seika).Келемиштерге Pharma (Япония) аралашмасы менен интраперитонеалдык инъекция аркылуу наркоз берилди.Анестезиядан кийин алар трахеянын айланасындагы жүндү алып салуу, эндотрахеалдык түтүктү (ET; 16 Га венага каннула, Terumo BCT) киргизүү жана термикалык баштык камтыган атайын жасалган сүрөт пластинасынын үстүндө жаткан абалда иммобилизациялоо жолу менен сүрөткө тартууга даярдалган. дене температурасын кармап туруу үчүн.22. Сүрөттөө плитасы андан кийин 2а-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, рентген сүрөтүндө трахеяны туурасынан тегиздөө үчүн сүрөттөө кутучасындагы үлгү баскычына бир аз бурч менен бекитилди.
(a) SPring-8 сүрөттөө бирдигинде In vivo сүрөттөө орнотуу, кызыл чекиттүү сызык менен белгиленген рентген нурунун жолу.(b,c) Трахея магнитин локализациялоо ортогоналдуу орнотулган эки IP камераны колдонуу менен алыстан аткарылган.Экрандагы сүрөттөлүштүн сол жагында башты кармап турган зым илмекти жана ET түтүгүнүн ичине орнотулган жеткирүү каналын көрө аласыз.
100 мкл айнек шприц менен алыстан башкарылуучу шприц насос системасы (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) PE10 түтүкчөсүнө (0,61 мм OD, 0,28 мм ID) 30 Ga ийне аркылуу туташтырылган.Эндотрахеалдык түтүктү киргизүүдө учу трахеяда туура абалда экендигин текшерүү үчүн түтүктү белгилеңиз.Микронасостун жардамы менен шприцтин поршени чыгарылып, түтүктүн учу жеткириле турган МП үлгүсүнө чөмүлдүрүлгөн.Жүктөлгөн жеткирүү түтүгү андан кийин эндотрахеалдык түтүккө киргизилип, учу биз күткөн колдонулган магнит талаасынын эң күчтүү жерине жайгаштырылды.Сүрөттү алуу биздин Arduino негизиндеги убакыт кутучасына туташтырылган дем детекторунун жардамы менен көзөмөлдөнүп, бардык сигналдар (мисалы, температура, дем алуу, жапкычты ачуу/жабуу жана сүрөттү алуу) Powerlab жана LabChart (AD Instruments, Сидней, Австралия) аркылуу жазылган. 22 Сүрөткө тартууда Корпус жок болгондо, эки IP камера (Panasonic BB-SC382) бири-бирине болжол менен 90° жайгаштырылган жана сүрөт тартуу учурунда трахеяга салыштырмалуу магниттин абалын көзөмөлдөө үчүн колдонулган (Figure 2b, c).Кыймыл артефакттарын азайтуу үчүн, терминалдык дем алуу агымы платосунда дем алуу үчүн бир сүрөт алынды.
Магнит экинчи баскычка тиркелет, ал сүрөт тартуу органынын сыртында алыстан жайгашышы мүмкүн.Магниттин ар кандай позициялары жана конфигурациялары сыналды, анын ичинде: трахеянын үстүндө болжол менен 30° бурчка жайгаштырылган (конфигурациялар 2а жана 3а сүрөттөрүндө көрсөтүлгөн);бир магнит жаныбардын үстүндө, экинчиси ылдыйда, уюлдарды тартуу үчүн орнотулган (сүрөт 3b)., жаныбардын үстүндө бир магнит жана ылдыйда бир магнит, түртүү үчүн орнотулган уюлдар менен (3c-сүрөт), бир магнит жогоруда жана трахеяга перпендикуляр (3d-сүрөт).Жаныбарды жана магнитти орнотуп, текшерилип жаткан МПны шприц насосуна жүктөгөндөн кийин, сүрөттөрдү алгандан кийин 4 мкл/сек ылдамдыкта 50 мкл дозасын бериңиз.Андан кийин магнит трахея боюнча алдыга жана артка жылдырылып, сүрөттөрдү алууну улантат.
In vivo сүрөттөө үчүн магнит конфигурациясы (a) трахеянын үстүндө болжол менен 30° бурчта турган бир магнит, (б) тартылуу үчүн конфигурацияланган эки магнит, (c) түртүү үчүн конфигурацияланган эки магнит, (г) бир магниттин үстүндө жана перпендикуляр трахея.Байкоочу трахея аркылуу өпкөсүнө чейин оозунан ылдый карады жана рентген нуру чычкандын сол тарабынан өтүп, оң жагынан чыкты.Магнит же дем алуу жолунун узундугу боюнча же рентген нурунун багыты боюнча трахеянын үстүндө солго жана оңго жылдырылат.
Биз ошондой эле дем алуу жана жүрөктүн кагышы аралашпаган учурда аба жолдорундагы бөлүкчөлөрдүн көрүнүшүн жана жүрүм-турумун аныктоого аракет кылдык.Ошондуктан, сүрөткө тартуу мезгилинин аягында, пентобарбиталдын ашыкча дозалануусунан улам жаныбарлар адамдык эвтанизацияга учураган (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, АКШ; ~65 мг/кг ip).Кээ бир жаныбарлар сүрөт аянтчасында калтырылган, ал эми дем алуу жана жүрөк согушу токтогондон кийин, дем алуу жолунун бетинде депутат көрүнбөсө, МПнын кошумча дозасын кошуп, сүрөт тартуу процесси кайталанган.
Натыйжадагы сүрөттөр жалпак жана караңгы талаа үчүн оңдолуп, андан кийин MATLAB (R2020a, The Mathworks) программасында жазылган ыңгайлаштырылган сценарийдин жардамы менен киного (секундасына 20 кадр; дем алуу ылдамдыгына жараша 15–25 × нормалдуу ылдамдык) чогултулган.
LV ген векторун жеткирүү боюнча бардык изилдөөлөр Аделаида университетинин лабораториялык жаныбарларды изилдөө борборунда жүргүзүлдү жана SPring-8 экспериментинин натыйжаларын магнит талаасынын катышуусунда LV-MP жеткирүү in vivo гендин трансферин күчөтө алаар-албасын баалоого багытталган. .MF жана магнит талаасынын таасирин баалоо үчүн жаныбарлардын эки тобу дарыланган: бир топко магнит жайгаштырылган LV MF, ал эми экинчи топко магнитсиз LV MF менен контролдук топ сайылган.
LV ген векторлор мурда сүрөттөлгөн ыкмаларды 25, 26 колдонуу менен түзүлгөн.LacZ вектору MPSV конститутивдүү промотору (LV-LacZ) менен шартталган ядролук локализацияланган бета-галактозидаза генин билдирет, ал трансдукцияланган клеткаларда көк түстөгү реакция продуктуну пайда кылат, өпкө тканынын фронтторунда жана бөлүмдөрүндө көрүнүп турат.Титрлөө ТУ/мл титрди эсептөө үчүн гемоцитометрди колдонуу менен LacZ-оң клеткалардын санын кол менен санап, клетка культураларында аткарылган.Ташуучулар -80°С температурада криоконсервацияланат, колдонуудан мурун эритет жана CombiMag менен 1:1 аралаштыруу жана жеткирүүгө чейин кеминде 30 мүнөт музда инкубациялоо жолу менен байланат.
Кадимки Sprague Dawley келемиштери (n = 3/топ, ~2-3 анестезияланган ip 0,4мг/кг медетомидин (Домитор, Илиум, Австралия) жана 60мг/кг кетамин (Ilium, Австралия) 1 айлык кезинде) ip ) 16 Га тамырга канюла менен инъекциялык жана хирургиялык эмес оозеки каннуляция.Трахеянын дем алуу жолдорунун кыртышынын LV трансдукциясын алуусун камсыз кылуу үчүн, ал трахеянын аба жолунун бети зым себет менен октук жактан сүртүлгөн биздин мурда сүрөттөлгөн механикалык бузулуу протоколу менен шартталган (N-Circle, учу жок нитинол таш экстрактору NTSE-022115 ) -UDH , Кук медициналык, АКШ) 30 б28.Андан кийин, биокоопсуздук кабинетинде бузулуудан болжол менен 10 мүнөт өткөндөн кийин, LV-MP трахеяга киргизилди.
Бул экспериментте колдонулган магнит талаасы in vivo рентгендик изилдөөгө окшош конфигурацияланган, ошол эле магниттер трахеянын үстүндө дистилляциялык стент кыскычтары менен кармалып турган (4-сүрөт).50 мкл көлөмү (2 x 25 мкл аликвот) LV-MP трахеяга (n = 3 жаныбар) мурда сүрөттөлгөндөй гел учтуу пипетка аркылуу жеткирилди.Контролдук топ (n = 3 жаныбар) магнитсиз эле LV-MP алды.Инфузия аяктагандан кийин каннула эндотрахеалдык түтүктөн чыгарылып, жаныбар экстубацияланат.Магнит алынып салынганга чейин 10 мүнөт бою ордунда турат.Келемиштерге мелоксикам (1 мл/кг) (Ilium, Австралия) тери астына дозаланган, андан кийин 1 мг/кг атимазол гидрохлоридинин (Антиседан, Зоетис, Австралия) интраперитонеалдык инъекциясы аркылуу наркоз алынып салынган.Келемиштерди жылуу кармашкан жана наркоздон толук айыгып кеткенге чейин байкоо жүргүзүшкөн.
LV-MP жеткирүү аппараты биологиялык коопсуздук кабинетинде.Сиз ET түтүкчөсүнүн ачык боз Luer-lock жеңи ооздон чыгып турганын жана сүрөттө көрсөтүлгөн гел пипеткасынын учу ET түтүгү аркылуу трахеяга керектүү тереңдикке киргизилгенин көрө аласыз.
LV-MP башкаруу процедурасынан бир жума өткөндөн кийин, жаныбарлар 100% СО2 менен дем алуу жолу менен адамдык курмандыкка чалышты жана LacZ экспрессиясы биздин стандарттуу X-gal дарылоону колдонуу менен бааланды.Эндотрахеалдык түтүктү жайгаштыруудан улам механикалык зыян же суюктуктун кармалышы анализге кирбеши үчүн эң каудалдык кемирчектин үч шакеги алынып салынды.Ар бир трахея узунунан кесилип, анализдөө үчүн эки жарымга бөлүндү жана люминалдык бетти визуалдаштыруу үчүн Minutien ийнесинин (Fine Science Tools) жардамы менен силикон резинасы бар чөйчөккө (Sylgard, Dow Inc) салынды.Трансдукцияланган клеткалардын бөлүштүрүлүшү жана мүнөзү DigiLite камерасы жана TCapture программасы (Tucsen Photonics, Кытай) менен Nikon микроскоптун (SMZ1500) жардамы менен фронталдык сүрөткө тартуу аркылуу тастыкталды.Сүрөттөр 20x чоңойтууда (анын ичинде трахеянын толук туурасы үчүн максималдуу параметр) алынган, трахеянын бүткүл узундугу кадам сайын көрсөтүлүп, сүрөттөрдүн “тигишине” мүмкүндүк берүү үчүн ар бир сүрөттүн ортосунда жетиштүү дал келүү камсыздалган.Ар бир трахеядагы сүрөттөр андан кийин тегиздик кыймыл алгоритмин колдонуу менен Composite Image Editor 2.0.3 (Microsoft Research) версиясын колдонуу менен бирдиктүү композиттик сүрөткө бириктирилген. Ар бир жаныбардан алынган трахеялык композиттик сүрөттөрдүн ичиндеги LacZ экспрессиясынын аймагы 0,35 < Реңк < 0,58, Каныккандык > 0,15 жана Мааниси < 0,7 орнотууларды колдонуу менен, мурда сүрөттөлгөндөй28 автоматташтырылган MATLAB скриптин (R2020a, MathWorks) жардамы менен өлчөнгөн. Ар бир жаныбардан алынган трахеялык композиттик сүрөттөрдүн ичиндеги LacZ экспрессиясынын аянты 0,35 < Реңк < 0,58, Каныккандык > 0,15 жана Мааниси < 0,7 орнотууларды колдонуу менен, мурда сүрөттөлгөндөй28 автоматташтырылган MATLAB скриптин (R2020a, MathWorks) жардамы менен өлчөнгөн. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценарий MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием <50, 0,15 и значение <0 ,7. Ар бир жаныбардан алынган композициялык трахеялык сүрөттөрдөгү LacZ экспрессиясынын аянты 0,35 орнотууларды колдонуу менен, мурда сүрөттөлгөндөй28 автоматташтырылган MATLAB скрипти (R2020a, MathWorks) менен сандык аныкталды.0,15 жана мааниси <0 ,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图图合图图国行量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置。Баскычтар表达 量化 ， 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。 ……………………………………………………………………… HIP Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определили с использованием автоматизированного сценарий MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек550, настроек 80, значение <0,7 . Ар бир жаныбардын трахеясынын курама сүрөттөрүндөгү LacZ экспрессиясынын аймактары автоматташтырылган MATLAB скрипти (R2020a, MathWorks) аркылуу 0,35 < реңк < 0,58, каныккандык> 0,15 жана мааниси < 0,7 орнотууларды колдонуу менен мурда сүрөттөлгөн.GIMP v2.10.24 версиясында кыртыш контурларына көз салуу менен, кыртыштын аймагын аныктоо жана трахея тканынан тышкары кандайдыр бир жалган аныктамаларды алдын алуу үчүн ар бир курама сүрөт үчүн маска кол менен түзүлгөн.Ар бир жаныбардын бардык курама сүрөттөрүнүн боёлгон жерлери ошол жаныбардын жалпы боёгон аянтын берүү үчүн чогултулду.Андан кийин боёлгон аймак нормалдаштырылган аймакты алуу үчүн масканын жалпы аянтына бөлүнгөн.
Ар бир трахея парафинге салынып, калыңдыгы 5 мкм болгон.Бөлүмдөр 5 мүнөткө нейтралдуу тез кызыл түскө боёлуп, сүрөттөр Nikon Eclipse E400 микроскобу, DS-Fi3 камерасы жана NIS элементтерин тартуу программасы (5.20.00 версиясы) аркылуу алынган.
Бардык статистикалык анализдер GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) ичинде аткарылган.Статистикалык маани p ≤ 0,05 деп белгиленген.Нормалдуулук Shapiro-Wilk тестинин жардамы менен текшерилген жана LacZ боёгундагы айырмачылыктар жупташтырылбаган t-тест аркылуу бааланган.
1-таблицада сүрөттөлгөн алты МП PCXI тарабынан текшерилген, ал эми көрүү мүмкүнчүлүгү 2-таблицада сүрөттөлгөн. Эки полистирол МП (MP1 жана MP2; 18 мкм жана 0,25 мкм) PCXI тарабынан көрүнгөн эмес, бирок калган үлгүлөрдү аныктоого мүмкүн болгон. (мисалдар 5-сүрөттө көрсөтүлгөн).MP3 жана MP4 начар көрүнөт (10-15% Fe3O4; 0,25 мкм жана 0,9 мкм).MP5 (98% Fe3O4; 0,25 мкм) сыналган эң кичинекей бөлүкчөлөрдү камтыса да, ал эң айкын болгон.CombiMag MP6 продуктуну айырмалоо кыйын.Бардык учурларда, магнитти капиллярга параллель алдыга жана артка жылдыруу аркылуу биздин МФны аныктоо жөндөмүбүз бир топ жакшырды.Магниттер капиллярдан алыстаган сайын, бөлүкчөлөр узун чынжырлар менен сууруп чыгышкан, бирок магниттер жакындаган сайын жана магнит талаасынын күчү жогорулаган сайын, бөлүкчөлөр капиллярдын үстүнкү бетине жылган сайын бөлүкчөлөрдүн чынжырлары кыскарган (Кошумча Video S1 караңыз. : MP4), бетиндеги бөлүкчөлөрдүн тыгыздыгын жогорулатуу.Тескерисинче, магнит капиллярдан чыгарылганда, талаанын күчү азайып, депутаттар капиллярдын үстүнкү бетинен созулган узун чынжырларга кайра тизилет (Кошумча Video S2: MP4 караңыз).Магнит кыймылын токтоткондон кийин, бөлүкчөлөр тең салмактуулук абалына жеткенден кийин дагы бир канча убакытка чейин кыймылдай беришет.МП капиллярдын үстүнкү бетине карай жана андан алыстаган сайын, магниттик бөлүкчөлөр суюктук аркылуу таштандыларды тартууга ыкташат.
PCXI боюнча MP көрүнөө үлгүлөрүнүн ортосунда бир топ айырмаланат.(а) MP3, (б) MP4, (c) MP5 жана (г) MP6.Бул жерде көрсөтүлгөн бардык сүрөттөр капиллярдын үстүндө болжол менен 10 мм жайгашкан магнит менен тартылган.Көрүнүп турган чоң тегерекчелер капиллярларда камалып калган аба көбүкчөлөрү болуп саналат, алар фазалык контраст сүрөтүнүн ак жана кара четинин өзгөчөлүктөрүн ачык көрсөтүп турат.Кызыл кутуча контрастты күчөтүүчү чоңойтууну көрсөтөт.Баардык фигураларда магниттик схемалардын диаметрлери масштабдуу эмес жана көрсөтүлгөндөн болжол менен 100 эсе чоң экенине көңүл буруңуз.
Магнит капиллярдын үстүн бойлой солго жана оңго жылган сайын, МП жиптин бурчу магнитке дал келүү үчүн өзгөрөт (6-сүрөттү караңыз), ошону менен магнит талаасынын сызыктары аныкталат.MP3-5 үчүн аккорд босого бурчка жеткенден кийин бөлүкчөлөр капиллярдын үстүнкү бети боюнча сүйрөлөт.Бул көбүнчө депутаттардын магнит талаасы эң күчтүү болгон жерге жакын чоң топторго топтолушуна алып келет (Кошумча Video S3: MP5 караңыз).Бул өзгөчө капиллярдын аягына жакын сүрөткө тартууда айкын көрүнүп турат, бул МП суюктук-аба интерфейсинде топтолуп, топтолушуна алып келет.MP3-5тегиге караганда айырмалоо кыйын болгон MP6дагы бөлүкчөлөр магнит капиллярды бойлой жылган кезде сүйрөлгөн жок, бирок MP саптары диссоциацияланып, бөлүкчөлөр көрүнүүдө (Кошумча Video S4: MP6 караңыз).Кээ бир учурларда, колдонулган магнит талаасы магнитти сүрөт тартып жаткан жерден бир топ аралыкка жылдыруу менен азайганда, калган депутаттар сапта калган тартылуу күчү менен түтүктүн ылдыйкы бетине акырындык менен түшөт (Кошумча Video S5: MP3 караңыз) .
МП саптын бурчу магнит капиллярдын үстүндө оңго жылган сайын өзгөрөт.(а) MP3, (б) MP4, (c) MP5 жана (г) MP6.Кызыл кутуча контрастты күчөтүүчү чоңойтууну көрсөтөт.Кошумча видеолор маалыматтык максатта экенин эске алыңыз, анткени алар бөлүкчөлөрдүн маанилүү структурасын жана бул статикалык сүрөттөрдө көргөзүүгө мүмкүн болбогон динамикалык маалыматты ачып берет.
Биздин тесттер магнитти трахея боюнча жай алдыга жана артка жылдыруу in vivo татаал кыймылдын контекстинде MF визуализациясын жеңилдете тургандыгын көрсөттү.Полистирол мончоктору (MP1 жана MP2) капиллярда көрүнбөгөндүктөн in vivo сыноолор жүргүзүлгөн жок.Калган төрт МФнын ар бири магниттин узун огу трахеянын үстүндө вертикальга карата 30° бурчта жайгашкан in vivo менен сыналган (2b жана 3a-сүрөттөрдү караңыз), анткени бул MF чынжырчаларынын узундугуна алып келип, натыйжалуураак болгон. магнитке караганда..конфигурация токтотулду.MP3, MP4 жана MP6 тирүү жаныбарлардын трахеясынан табылган эмес.Жаныбарларды адам өлтүргөндөн кийин келемиштердин дем алуу жолдорун визуализациялоодо, шприц насосу аркылуу кошумча көлөм кошулганда да бөлүкчөлөр көрүнбөй калган.MP5 темир кычкылынын эң жогорку мазмунуна ээ болгон жана бир гана көзгө көрүнгөн бөлүкчө болгон, ошондуктан ал MP жүрүм-турумуна баа берүү жана in vivo мүнөздөө үчүн колдонулган.
MF киргизүү учурунда трахеянын үстүнө магнитти жайгаштыруу көптөгөн MFs көрүү талаасында топтолгон, бирок баары эмес, алып келди.Бөлүкчөлөрдүн трахеяга кириши адам тарабынан эвтанизацияланган жаныбарларда эң жакшы байкалат.7-сүрөт жана кошумча Video S6: MP5 вентралдык трахеянын бетиндеги бөлүкчөлөрдүн тез магниттик кармалышын жана тегиздөөсүн көрсөтөт, бул депутаттар трахеянын каалаган жерлерине багытталышы мүмкүн экенин көрсөтүп турат.MF жеткирилгенден кийин трахеяны бойлото дисталдан издегенде, кээ бир МФлар каринага жакыныраак табылган, бул бардык МФтерди чогултуу жана кармап туруу үчүн магнит талаасынын күчү жетишсиздигин көрсөтүп турат, анткени алар суюктуктарды берүү учурунда магнит талаасынын максималдуу күчү болгон аймак аркылуу жеткирилген.процесс.Бирок, төрөттөн кийинки МП концентрациясы сүрөттүн айланасында жогору болгон, бул көптөгөн депутаттар колдонулган магнит талаасынын күчү эң жогору болгон аба жолдорунун аймактарында калганын көрсөтүп турат.
Сүрөттөр (а) мурун жана (б) MP5ти жакында эвтанизацияланган келемиштин трахеясына жеткирилгенден кийин, магнит менен сүрөттөө аянтынын үстүнө коюлган.Сүрөттөлгөн аймак эки кемирчек шакекченин ортосунда жайгашкан.Депутат жеткирилгенге чейин дем алуу жолдорунда бир аз суюктук бар.Кызыл кутуча контрастты күчөтүүчү чоңойтууну көрсөтөт.Бул сүрөттөр S6: MP5 кошумча видеосунда көрсөтүлгөн видеодон алынган.
Магниттин трахея боюнча in vivo жылышы капиллярларда байкалгандай аба жолунун бетиндеги МП чынжырынын бурчунун өзгөрүшүнө алып келди (8-сүрөттү жана S7 кошумча видеосун караңыз: MP5).Бирок, биздин изилдөөбүздө депутаттарды капиллярлардай кылып, жандуу дем алуу жолдорунун бети боюнча сүйрөө мүмкүн эмес.Кээ бир учурларда, магнит солго жана оңго жылган сайын МП чынжыр узарат.Эң кызыгы, магнит трахея боюнча узунунан жылдырганда бөлүкчөлөр чынжыр суюктуктун беттик катмарынын тереңдигин өзгөртөөрүн, ал эми магнитти түздөн-түз өйдө жылдырганда жана бөлүкчөлөрдүн чынжырын вертикалдуу абалга айландырганда кеңейээрин аныктадык (к. Кошумча Video S7).: MP5 0:09, ылдыйкы оң).Мүнөздүү кыймыл схемасы магнит трахеянын үстүн капталдан жылдырганда өзгөргөн (б.а., трахеянын узундугу боюнча эмес, жаныбардын сол же оң жагы).Бөлүкчөлөр кыймыл учурунда дагы эле даана көрүнүп турду, бирок магнит трахеядан чыгарылганда, бөлүкчөлөрдүн жиптеринин учтары көрүнүп калды (Кошумча Video S8: MP5, 0:08ден баштап караңыз).Бул айнек капиллярдагы колдонулуучу магнит талаасынын таасири астында магнит талаасынын байкалган жүрүм-турумуна дал келет.
Тирүү анестезияланган келемиштин трахеясында MP5ти көрсөткөн үлгү сүрөттөр.(а) Магнит трахеянын үстүндө жана сол жагында сүрөттөрдү алуу үчүн колдонулат, андан кийин (б) магнитти оңго жылдыргандан кийин.Кызыл кутуча контрастты күчөтүүчү чоңойтууну көрсөтөт.Бул сүрөттөр S7дин кошумча видеосунда көрсөтүлгөн видеодон алынган: MP5.
Эки уюл трахеянын үстүндө жана ылдыйда түндүк-түштүк багытында күүлөнгөндө (б.а. тартуу; 3б-сүрөт) МП аккорддору узунураак пайда болуп, трахеянын арткы бетинде эмес, каптал дубалында жайгашкан. трахея (Тиркемени караңыз).Video S9: MP5).Бирок, бир сайтта бөлүкчөлөрдүн жогорку концентрациясы (б.а. трахеянын арка бети) суюктук башкаруудан кийин, адатта, бир магниттик аппарат менен пайда болгон кош магниттик аппаратты колдонуу менен аныкталган эмес.Андан кийин, бир магнит карама-каршы уюлдарды түртүүгө конфигурацияланганда (3c-сүрөт), көрүү талаасында көрүнгөн бөлүкчөлөрдүн саны жеткирилгенден кийин көбөйгөн эмес.Эки магнит конфигурациясын тең орнотуу магниттик талаанын күчтүүлүгүнөн улам кыйынга турат, ал магниттерди тартат же түртөт.Орнотуу андан кийин аба жолдоруна параллелдүү, бирок аба жолдору аркылуу 90 градус бурчта өтүп, күч сызыктары трахеянын дубалын ортогоналдуу кесип өтүүчү бир магнитке өзгөртүлдү (3d-сүрөт), бөлүкчөлөрдүн агрегациялануу мүмкүнчүлүгүн аныктоо үчүн багытталган багыт. каптал дубал.байкалсын.Бирок, бул конфигурацияда эч кандай аныкталуучу MF топтоо кыймылы же магнит кыймылы болгон эмес.Бардык ушул натыйжалардын негизинде, ген алып жүрүүчүлөрдү in vivo изилдөөлөр үчүн бир магнит жана 30 градустук багыты бар конфигурация тандалды (сүрөт 3a).
Жаныбар адамдык курмандыкка чалынгандан кийин дароо эле бир нече жолу тартылганда, ткандардын кыймылынын кийлигишүүсүнүн жоктугу так, кемирчектер аралык талаада магниттин котормо кыймылына ылайык "термелүүчү" майдараак, кыскараак бөлүкчөлөрдүн сызыктарын билүүгө мүмкүндүк берген.MP6 бөлүкчөлөрүнүн болушун жана кыймылын так көрө аласыз.
LV-LacZ титери 1,8 x 108 IU/мл болгон жана CombiMag MP (MP6) менен 1:1 аралаштыргандан кийин, жаныбарларга 50 мкл трахеялык дозасы 9 x 107 IU/ml LV унаасынын (б.а. 4,5) сайылган. x 106 TU/келемиш).).).Бул изилдөөлөрдө, эмгек учурунда магнитти жылдыруунун ордуна, биз магнитти бир абалда бекиттик: LV өткөргүч (а) магнит талаасы жок болгон учурда вектордук жеткирүүгө салыштырмалуу жакшыртылышы мүмкүнбү жана (б) аба жолу багытталат.Клеткалар жогорку дем алуу жолдорунун магниттик максаттуу аймактарында которулат.
Магниттердин болушу жана CombiMagди LV векторлору менен айкалыштырып колдонуу, биздин стандарттык LV векторун жеткирүү протоколу сыяктуу жаныбарлардын ден соолугуна терс таасирин тийгизген жок.Механикалык бузулууга дуушар болгон трахея аймагынын фронталдык сүрөттөрү (Кошумча 1-сүрөт) LV-MP менен дарыланган топтун магниттин катышуусунда трансдукциянын кыйла жогору экендигин көрсөттү (сүрөт 9a).Контролдоо тобунда бир аз гана көк LacZ боёгу болгон (сүрөт 9b).X-Gal менен боёлгон нормалдаштырылган аймактарды сандык аныктоо магнит талаасынын катышуусунда LV-MP башкаруу болжол менен 6 эсе жакшырганын көрсөттү (сүрөт. 9c).
LV-MP (а) магнит талаасынын катышуусунда жана (б) магнит жок болгон трахеалдык трансдукцияны көрсөткөн композиттик сүрөттөрдүн мисалы.(c) Магниттин жардамы менен трахеядагы LacZ трансдукциясынын нормалдаштырылган зонасында статистикалык жактан олуттуу жакшыруу (*p = 0,029, t-тест, n = 3 топ үчүн, орточо ± стандарттык ката).
Нейтралдуу тез кызыл түскө боёлгон бөлүкчөлөр (мисалы, кошумча 2-сүрөттө көрсөтүлгөн) LacZ менен боёлгон клеткалар мурда билдирилген үлгүдө жана ошол эле жерде бар экенин көрсөттү.
Дем алуу жолдорунун ген терапиясындагы негизги маселе, кызыккан аймактарда алып жүрүүчү бөлүкчөлөрдү так локализациялоо жана аба агымы жана активдүү былжырды тазалоо шартында мобилдик өпкөдөгү трансдукциянын жогорку деңгээлине жетишүү бойдон калууда.Муковисцидоздо дем алуу органдарынын ооруларын дарылоого арналган LV ташыгычтары үчүн өткөргүч аба жолдорунда ташуучу бөлүкчөлөрдүн болуу убактысын көбөйтүү ушул убакка чейин ишке ашпай турган максат болуп келген.Castellani ж.б. белгилегендей, трансдукцияны күчөтүү үчүн магнит талаасын колдонуу электропорация сыяктуу башка ген жеткирүү ыкмаларына караганда артыкчылыктарга ээ, анткени ал жөнөкөйлүктү, үнөмдөөнү, локализацияланган жеткирүүнү, натыйжалуулукту жогорулатууну жана инкубация убактысын кыскарта алат.жана балким, транспорттун азыраак дозасы10.Бирок, тышкы магниттик күчтөрдүн таасири астында дем алуу жолдорунда магниттик бөлүкчөлөрдүн in vivo чөгүүсү жана жүрүм-туруму эч качан сүрөттөлгөн эмес жана чындыгында бул ыкманын бузулбаган тирүү аба жолдорунда ген экспрессиясынын деңгээлин жогорулатууга жөндөмдүүлүгү in vivo көрсөткөн эмес.
PCXI синхротронундагы биздин in vitro эксперименттерибиз MP полистиролдон башка биз сынаган бардык бөлүкчөлөр биз колдонгон сүрөт орнотууда көрүнүп турганын көрсөттү.Магнит талаасы болгон учурда магнит талаасы жиптерди пайда кылат, алардын узундугу бөлүкчөлөрдүн түрүнө жана магнит талаасынын күчүнө (б.а. магниттин жакындыгы жана кыймылына) байланыштуу.10-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, биз байкаган жиптер ар бир жеке бөлүкчө магниттелгенде жана өзүнүн жергиликтүү магнит талаасын индукциялаганда пайда болот.Бул өзүнчө талаалар башка бөлүкчөлөрдү тартуу жана түртүү жергиликтүү күчтөрдүн жергиликтүү күчтөрүнөн улам топ жип кыймылдары менен башка окшош бөлүкчөлөрдү чогултууга жана туташууга себеп болот.
Диаграмма (a, b) суюктукка толгон капиллярлардын жана (c, d) аба менен толтурулган трахеянын ичинде пайда болгон бөлүкчөлөрдүн чынжырларын көрсөткөн.Капиллярлар жана трахеялар масштабга тартылбаганына көңүл буруңуз.Панел (а) ошондой эле чынжырга тизилген Fe3O4 бөлүкчөлөрүн камтыган MFтин сыпаттамасын камтыйт.
Магнит капиллярдын үстүнөн жылыганда, бөлүкчө жипинин бурчу Fe3O4 камтыган MP3-5 үчүн критикалык чекке жеткен, андан кийин бөлүкчөлөрдүн жипчеси мурунку абалында калбай, бетти бойлоп жаңы абалга жылган.магнит.Бул таасир, кыязы, айнек капиллярдын бети бул кыймылды ишке ашыруу үчүн жетиштүү жылмакай болгондуктан пайда болот.Кызыктуусу, MP6 (CombiMag) мындай иш-аракет кылган эмес, балким, бөлүкчөлөр кичирээк болгондуктан, башка каптоо же беттик заряды бар же менчик ташуучу суюктук алардын кыймылдоо жөндөмүнө таасир эткен.CombiMag бөлүкчөлөрүнүн сүрөттөлүшүндөгү контраст дагы алсызыраак, бул суюктук менен бөлүкчөлөр бирдей тыгыздыкка ээ болушу мүмкүн жана ошондуктан бири-бирине оңой жыла албайт.Магнит өтө тез кыймылдаса, бөлүкчөлөр тыгылып калышы мүмкүн, бул магнит талаасынын күчү суюктуктагы бөлүкчөлөрдүн ортосундагы сүрүлүүнү ар дайым жеңе албастыгын көрсөтүп, магнит талаасынын күчү жана магнит менен максаттуу аймактын ортосундагы аралык бирдикте калбашы керек дегенди билдирет. сюрприз.маанилүү.Бул жыйынтыктар ошондой эле магниттер максаттуу аймак аркылуу агып жаткан көптөгөн микробөлүкчөлөрдү кармай алганы менен, CombiMag бөлүкчөлөрүн трахеянын бети боюнча жылдыруу үчүн магниттерге ишенүү мүмкүн эмес экенин көрсөтүп турат.Ошентип, биз in vivo LV MF изилдөөлөр аба дарагынын белгилүү бир аймактарын физикалык максаттуу статикалык магниттик талааларды колдонуу керек деген жыйынтыкка келдик.
Бөлүкчөлөр денеге жеткирилгенден кийин, аларды дененин татаал кыймылдуу кыртышынын контекстинде аныктоо кыйынга турат, бирок алардын аныктоо жөндөмү магнитти трахеянын горизонталдуу кыймылдатып, MP саптарын "кыймылдатуу" үчүн жакшыртылды.Чыныгы убакыт режиминде сүрөткө тартуу мүмкүн болсо да, жаныбар адам өлтүрүлгөндөн кийин бөлүкчөлөрдүн кыймылын аныктоо оңой.МП концентрациясы, адатта, магнит сүрөттөлгөн аймактын үстүндө жайгашкан бул жерде эң жогору болгон, бирок кээ бир бөлүкчөлөр адатта трахеядан ылдыйда табылган.In vitro изилдөөлөрдөн айырмаланып, бөлүкчөлөрдү магниттин кыймылы менен трахеяга сүйрөп салуу мүмкүн эмес.Бул табылга трахеянын бетин каптаган былжыр дем алган бөлүкчөлөрдү кантип иштетип, аларды былжырга кармап, кийинчерээк былжыр-цилиардык тазалоо механизми аркылуу тазалайт.
Биз тартылуу үчүн трахеянын үстүндө жана ылдыйда магниттерди колдонуу (сүрөт. 3b) бир чекитте жогорку топтолгон магнит талаасынын ордуна, бөлүкчөлөрдүн бир калыпта бөлүштүрүлүшүнө алып келиши мүмкүн болгон бир калыпта магнит талаасына алып келиши мүмкүн деп божомолдодук..Бирок биздин алдын ала изилдөөбүз бул гипотезаны ырастаган так далилдерди тапкан жок.Ошо сыяктуу эле, тебүү үчүн бир жуп магнитти коюу (3c-сүрөт) сүрөттүн аймагында бөлүкчөлөрдүн көбүрөөк отурушуна алып келген жок.Бул эки тыянак кош магниттик орнотуу MP көрсөткүчүнүн локалдык көзөмөлүн олуттуу түрдө жакшырта албастыгын жана натыйжада пайда болгон күчтүү магниттик күчтөрдү тууралоо кыйын экенин көрсөтүп турат, бул ыкманы азыраак практикалык кылат.Ошо сыяктуу эле, магнитти трахеянын үстүндө жана ориентациялоо (3d-сүрөт) да сүрөттөлгөн аймакта калган бөлүкчөлөрдүн санын көбөйткөн эмес.Бул альтернативалуу конфигурациялардын кээ бирлери ийгиликсиз болушу мүмкүн, анткени алар чөкүү зонасында магнит талаасынын күчүн төмөндөтөт.Ошентип, 30 градустагы бир магниттик конфигурация (3а-сүрөт) эң жөнөкөй жана эң эффективдүү in vivo сыноо ыкмасы болуп эсептелет.
LV-MP изилдөө LV векторлору CombiMag менен бириктирилгенде жана магнит талаасынын катышуусунда физикалык жактан бузулгандан кийин жеткирилгенде, трахеяда башкарууга салыштырмалуу трансдукциянын деңгээли бир топ жогорулаганын көрсөттү.Синхротрондук сүрөттөө изилдөөлөрүнүн жана LacZ натыйжаларынын негизинде магнит талаасы трахеяда LV кармап турууга жана өпкөнүн тереңине дароо кирген вектордук бөлүкчөлөрдүн санын азайтууга жөндөмдүү көрүндү.Мындай максаттуу жакшыртуулар жеткирилген титрлерди, максаттуу эмес трансдукцияларды, сезгенүү жана иммундук терс таасирлерди жана генди өткөрүп берүү чыгымдарын азайтып, жогорку натыйжалуулукка алып келиши мүмкүн.Маанилүүсү, өндүрүүчүнүн айтымында, CombiMag башка вирустук векторлор (мисалы, AAV сыяктуу) жана нуклеиндик кислоталар, анын ичинде башка ген өткөрүү ыкмалары менен бирге колдонулушу мүмкүн.